Repository Collection:

전사체와 유전체 분석을 통한 대장암의 종양 미세환경을 조절하는 특징 발굴

Sat, 31 Dec 2022 15:00:00 GMT

Title: 전사체와 유전체 분석을 통한 대장암의 종양 미세환경을 조절하는 특징 발굴 Author(s): 조은정 Abstract: Background Both intrinsic and extrinsic features of colorectal cancer (CRC) play important roles in cancer biology and cancer treatment. The intrinsic immuno-genomic characteristics of CRCs that shape the tumor immune microenvironment (TIM) are unclear. Tumor extrinsic features including tumor-infiltrating T-cells in TIM have demonstrated some predictive value for programmed death-1 (PD-1)/programmed death-ligand 1 (PD-L1) inhibitors response, but have not been fully identified in microsatellite instability-high (MSI-H) CRCs. Methods As described in chapter 2, in this study, we developed a patient-derived colorectal cancer organoid (CCO) model and performed pairwise analysis of 87 CCOs and their corresponding primary tumors. The TIM type of the primary tumor was classified as immuno-active, immuno-exhausted, or immuno-desert. In chapter 3, MSI-H CRC patients enrolled in three clinical trials of PD-1/PD-L1 blockade at Asan Medical Center (Seoul, Republic of Korea) were screened and classified into two groups according to treatment response. Their histopathologic features and expression of 730 immune-related genes from the NanoString platform were evaluated, and a machine learning- based classification model was built to predict treatment response among MSI-H CRCs patients. Results In chapter 2, we show that the gene expression profile, signaling pathway, major oncogenic mutation, and histology of the CCOs resemble those of the primary tumors. However, TIM of CCOs does not recapitulate the TIM of primary tumors. Two distinct intrinsic molecular subgroups of highly proliferative and mesenchymal-like phenotypes with clinical significance were identified in CCOs with various cancer signaling pathways. CCOs showed variable expression of cancer-specific immune-related genes such as those encoding HLA-I and HLA- II, in addition to molecules involved in immune checkpoint activation/inhibition. Among these genes, the expression of HLA-II in CCOs was associated with favorable patient survival. K- means clustering analysis based on HLA-II expression in CCOs revealed a subgroup of patients, in whom cancer cells exhibited Intrinsically Immunogenic Properties (Ca-IIP), and were characterized by high expression of signatures associated with HLA-I, HLA-II, antigen presentation, and immune stimulation. Patients with the Ca-IIP phenotype had an excellent prognosis, irrespective of age, disease stage, intrinsic molecular type, or TIM status. CA-IIP was negatively correlated with intrinsic E2F/MYC signaling. Analysis of the correlation between CCO immuno-genotype and TIM phenotype revealed that the TIM phenotype was associated with microsatellite instability, Wnt/β-catenin signaling, APC/KRAS mutations, and the unfolded protein response pathway linked to the FBXW7 mutation in cancer cells. However, Ca-IIP was not associated with the TIM phenotype. In chapter 3, a total of 27 patients (15 responders and 12 non-responders) were included. A high degree of lymphocytic/neutrophilic infiltration and an expansile tumor border were associated with treatment response and prolonged progression-free survival (PFS), while mucinous/signet-ring cell carcinoma was associated with a lack of treatment response and short PFS. Gene expression profiles revealed that the interferon-γ response pathway was enriched in the responder group. Of the top eight differentially expressed immune-related genes, PRAME had the highest fold change in the responder group. Higher expression of PRAME was independently associated with better PFS along with histologic subtypes in the multivariate analysis. The classification model using these genes showed good performance for predicting treatment response. Conclusions We identified a Ca-IIP phenotype associated with prognosis and immune-related gene expression characteristics associated with immune checkpoint inhibitors (ICIs) response in CRC. These findings provide an unprecedented opportunity to develop new strategies for optimal patient stratification in this era of immunotherapy. 배경 대장암의 암 내재적, 암 외재적 특징은 암 생물학과 암의 치료에서 중요한 역할을 하고 있다. 대장암의 종양 면역 미세환경을 조절하는 대장암의 암 내재적 면역-유전체적 특징은 불분명하다. 현미 부수체 불안정 대장암에서 종양 면역 미세환경의 종양 침윤 T-세포를 포함하는 암의 외재적 특징들은 PD-1/ PD-L1 억제제 반응성의 예측 인자이나, 아직 밝혀지지 않은 특징이 많다. 방법 2 장에서, 환자 유래 대장암 오가노이드 모델을 구축하고 짝이 되는 원발 암 조직과 함께 분석을 진행했다. 원발 암의 종양 면역 미세환경을 면역-활성, 면역-탈진, 면역- 결핍으로 분류했다. 3 장에서 PD-1/PD-L1 면역관문억제제 임상 시험에 참여한 현미 부수체 불안정 대장암 환자들을 치료 반응성에 따라 두 군으로 나누었다. 환자들의 조직병리학적 특징과 면역 관련 유전자들의 발현량을 측정하고, 환자의 치료 반응성을 예측하는 기계 학습 모델을 만들었다. 결과 2 장에서 환자 유래 대장암 오가노이드가 원발 암의 종양 면역 미세환경을 제외한 유전자 발현량, 신호 전달 경로, 주요 돌연변이와 조직학적 특징들을 잘 모사하는 것을 확인했다. 환자 유래 대장암 오가노이드에서 고도의 증식성을 가진 암 내재적 하위 그룹과 중간엽 표현형을 가진 암 내재적 하위 그룹, 서로 다른 총 두 가지 그룹이 확인되었다. 환자 유래 대장암 오가노이드는 HLA-I, HLA-II, 면역 관문 활성/억제에 관련된 암 특이적 면역 관련 유전자들에서 다양한 발현량을 보였다. 이 유전자들 중에서 환자 유래 대장암 오가노이드에서 HLA-II 의 발현이 좋은 생존율과 연관 있었다. 오가노이드에서 HLA-II 발현량에 기반한 K-중심 군집화 분석은 암세포 내재적 면역 특성을 보이는 하위그룹 (Ca-IIP) 을 밝혔고, Ca-IIP 그룹은 HLA-I, HLA-II, 항원제시, 면역 자극과 연관된 특징을 보였다. Ca-IIP 그룹은 연령, 질병 단계 또는 종양 면역 미세환경에 관계없이 우수한 예후를 보였으며 E2F/MYC 신호와 음의 상관 관계를 보였다. 환자 유래 대장암 오가노이드의 면역 특징과 종양 면역 미세환경 사이의 상관관계를 분석한 결과 종양 면역 미세환경은 현미 부수체 불안정, Wnt/β-catenin 신호 전달, APC/KRAS 돌연변이, FBXW7 돌연변이와 관계된 비접힘 단백질 반응과 연관되어 있었다. 그러나 Ca-IIP 는 종양 면역 미세환경과 연관되지 않았다. 3 장에서는 총 27 명의 환자(반응군 15 명, 비반응군 12 명)가 포함되었다. 높은 수준의 림프구/호중구의 침윤과 팽창성 종양 경계가 치료 반응성과 장기간 무진행생존과 연관 있었다. 점액/반지세포 암은 치료 반응 부족과 짧은 무진행생존과 연관되어있었다. 유전자 발현량 분석 결과 interferon-γ 반응 경로가 반응군에서 활성화되어있었다. 8 개의 차별발현유전자중PRAME이반응군에서차이나게높은발현을보였다.다변량분석 결과 PRAME 의 더 높은 발현은 조직학적 하위 유형과 함께 더 좋은 PFS 와 독립적으로 연관되었다. 차별 발현 유전자를 이용해 랜덤 포레스트 알고리즘으로 학습시킨 기계 학습 모델은 환자의 면역관문억제제 반응성을 높은 정확도로 예측했다. 결론 우리는 대장암에서 예후와 연관된 Ca-IIP 표현형과 면역관문억제제 치료 반응성과 연 관된 면역 관련 유전자 발현 특징을 찾았다. 이러한 발견은 면역 치료의 시대에 최적의 환자 계층화를 위한 새로운 전략을 개발할 기회를 줄 수 있다.

태반과 제대혈 유전자 발현 기반 임신 중 미세먼지 노출에 의한 소아 아토피피부염 발생 기전

Sat, 31 Dec 2022 15:00:00 GMT

Title: 태반과 제대혈 유전자 발현 기반 임신 중 미세먼지 노출에 의한 소아 아토피피부염 발생 기전 Author(s): 이승화 Abstract: 배경 및 목적: 면역기능 및 기관이 발달하는 임신 기간 동안 태아는 대기 오염을 포함한 여러 유해한 환경 노출의 영향을 받기 쉽다. 최근 연구들에서 출생 전 미세먼지(PM)의 노출과 소아 아토피피부염 발생 증가 사이의 연관성이 확인되고 있다. 그러나 출생 전 PM 노출이 소아 아토피피부염 발달 과정에 어떤 기전으로 영향을 미치는지는 명확히 밝혀지지 않은 상태이다. 출생 전 PM에 노출되면 산모와 태아를 연결하는 태반과 제대혈 내 유전자 발현에 영향을 미쳐 아토피피부염을 유발할 가능성이 있다. 본 연구는 태반 및 제대혈의 유전자 발현 변화를 조사하여 출생 전 미세먼지 노출에 의한 아토피피부염 발생 기전을 규명하고자 한다. 연구재료 및 방법: 이 연구는 한국의 일반 인구 기반 코코아 출생 코호트 연구에 등록된 1,180명의 피험자 데이터를 분석하였다. 로지스틱 회귀 분석을 이용하여 출생 전 PM2.5 노출과 아토피피부염 위험도를 확인하였다. 소아 아토피피부염 여부는 의사 진단에 대한 부모 설문지를 이용하였고, 출생 전 PM2.5 노출지수는 국가 모니터링 시스템을 기반한 토지 이용 회귀 모델로 추정하였다. 출생 전 PM2.5 노출에 의한 유전자 발현 변화가 아토피피부염 발생에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여 유전자 발현 마이크로어레이 분석을 시행하였다. 1,180명의 피험자 중 출생 전 PM2.5 노출 정도와 소아 아토피피부염 여부에 따라 48명 피험자의 태반 시료 및 46명 피험자의 제대혈 시료를 선정하여 Affymetrix GeneChip Array를 측정하였다. 마이크로어레이 분석을 통해 확인된 차등 발현 유전자를 이용하여 Gene ontology 및 pathway enrichment 분석을 포함한 다양한 생물정보학 분석을 수행하였다. 연구결과: 임신 중, 특히 임신 초기PM2.5의 고농도 노출은 소아 아토피피부염과 관련이 있었다 (aOR 1.68, 95% CI 1.16-2.44; aOR 1.48, 95% CI 1.02-2.1). 그러나 임신 중기 및 말기의 PM2.5 고농도 노출은 아토피피부염과 통계적으로 유의하지 않았다 (aOR 1.39, 95% CI 0.97-1.99; aOR 1.15, 95% CI 0.08-1.67). 태반 및 제대혈의 유전자 발현 연구에서, 출생 전 PM2.5 노출에 의해 태반 및 제대혈에서 유의하게 발현 차이를 보이는 163개의 중복 유전자를 확인하였고, 그 중 89개는 상향 조절된 반면 74개는 하향 조절되었다. KEGG pathway 분석에서는 발현 차이를 보인 유전자들이 'Ribosome biogenesis in eukaryotes', 'ubiquitin mediated proteolysis' 및 'chemokine signaling pathway' 관여하는 것으로 나타났다. 또한, PM2.5 노출이 높은 아토피피부염 환자군의 유전자 발현 프로필은 출생 전 PM2.5 노출이 낮은 건강한 대조군의 유전자 발현 프로필과 큰 차이를 보였다. 두 군의 t-test 비교를 통하여 유의한 발현 차이를 보이는 유전자(P-value <0.05, fold change≥ 1.5 또는 ≤ -1.5)를 태반에서 535개 및 제대혈에서 450개를 확인하였다. 유의미하게 발현 차이를 보이는 유전자에서 GO Immune system 분석 결과, 태반에서 확인된 유전자들은 ‘B cell homeostasis’와, 제대혈에서 확인된 유전자들은 ‘leukocyte and mononuclear cell differentiation’에 관여하는 것으로 확인되었다. 태반에서 확인된 유전자들의 KEGG pathway enrichment 분석을 통해, 태반에서 확인된 유전자들은 ‘chemical carcinogenesis-reactive oxygen species (ROS)’ 경로에 연관이 있으며, 제대혈에서 발현 차이를 보인 유전자들은 ‘NF-kappa B signaling pathway’를 포함하여 다양한 여러 신호 전달 경로가 출생 전 PM2.5 노출이 높은 아토피피부염 환자에서 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 특히, 출생 전 PM2.5 노출이 높은 아토피피부염 환자에서 ‘chemical carcinogenesis-ROS’ 및 ‘mitophagy’ 경로가 태반과 제대혈 둘 다에서 공통되게 상당한 연관성이 있는 것으로 보였다. 마지막으로, 유의한 차이를 보이는 경로에 연관된 유전자들 가운에 산전 PM2.5 노출과 강하게 연관되어 아토피피부염 발병에 영향을 미칠 가능성이 높은 태반 내 5개의 핵심 유전자(COX4I1, COX7B, NDUFA1, NDUFB1 and UBA52) 및 제대혈 내 2개 핵심 유전자(BNIP3 and CXCL8)를 확인하였다. 이 유전자들은 임신 초기 PM2.5노출 농도와 유의한 양의 상관관계를 보였다. 특히 태반에서 확인된 5개의 유전자들 모두 1세 호중구와 유의한 양의 상관관계가 있었으며, 제대혈에서 확인된 BNIP3 유전자는 3세 때 혈중 IgE 농도와 유의한 양의 상관관계를 보였다. 결론: 임신 중, 특히 임신 초기 PM2.5 노출은 소아 아토피피부염 발생 위험을 증가시킨다. 태반 및 제대혈 내 유의한 발현 차이를 보이는 유전자들이 연관된 ‘chemical carcinogenesis-ROS’, ‘mitophagy’ 및 ROS-연관 신호 경로는 출생 전 PM2.5 노출에 대한 면역 반응의 조절을 통하여 소아 아토피피부염 발병 기전에 관여할 수 있다. |Background: During gestation, when immune and organ system are developing, fetus is susceptible to the effects of environmental exposure including air pollution. Recent studies have highlighted the link between prenatal exposure to particulate matter (PM) and increased atopic dermatitis (AD) risk in children. However, it is not clear what mechanisms contribute to process of AD development during prenatal PM exposure. Exposure to PM during pregnancy may cause AD by affecting gene expression in the placenta and cord blood, which mediate between mothers and fetus. This study aims to identify this hypothesis and evaluate the mechanisms via investigating placental and cord blood gene expression changes. Materials and Methods: This study analyzed data of 1180 subjects enrolled in the COhort for Childhood Origin of Asthma and allergic diseases (COCOA) birth cohort study. The relationship between prenatal PM2.5 exposure and AD was confirmed using logistic regression analysis from the data of 1180 subjects. AD was identified by parental report of a physician’s diagnosis. Exposure to PM2.5 during pregnancy was estimated by land-use regression models based on national monitoring system. RNA gene expression microarray analysis was used to assess whether the gene expression changes influence AD susceptibility in prenatal PM2.5 exposure. Among 1180 subjects, subjects for the gene expression analysis were selected according to the level of prenatal PM2.5 exposure and AD in children, and microarray analysis was performed using an Affymetrix GeneChip Array in the placenta (48 samples) and the cord blood (46 samples). Various bioinformatics analyses, such as gene ontology (GO) and enriched molecular pathway analysis, were performed using differentially expressed genes (DEGs) identified from the microarray analysis. Results: Higher exposure to PM2.5 during pregnancy, especially the first trimester of gestation, was associated with AD (aOR 1.68, 95% CI 1.16-2.44; aOR 1.48, 95% CI 1.02-2.1, respectively). PM2.5 exposure during the second and third trimester of pregnancy was not robustly associated with AD (aOR 1.39, 95% CI 0.97-1.99; aOR 1.15, 95% CI 0.08-1.67, respectively). Through microarray analysis, 163 overlapping DEGs in the placenta and cord blood for prenatal PM2.5 exposure were identified, of which 89 were up-regulated whereas 74 were down-regulated. In Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis, these genes were revealed to be enriched in 'Ribosome biogenesis in eukaryotes', 'ubiquitin mediated proteolysis', and 'chemokine signaling pathway'. In addition, the gene expression profile from AD with high prenatal PM2.5 was significantly different from that of healthy controls with low PM2.5 exposure. 535 significant DEGs in the placenta and 450 significant DEGs in the cord blood (p-value < 0.05; |fold change| ≥ 1.5) were identified. The GO immune system analysis of DEGs with significant differences revealed that these genes are involved in B cell homeostasis in the placenta, whereas leukocyte and mononuclear cell differentiation in the cord blood. KEGG pathways analysis in the placenta revealed that the DEGs were enriched in chemical carcinogenesis-reactive oxygen species (ROS) and mitophagy pathways. Additionally, the KEGG enrichment analysis of DEGs in the cord blood revealed that various pathways including NF-kappa B (NF-κB) signaling pathway might have important roles in AD with high prenatal PM2.5 exposure. In particular, the ‘chemical carcinogenesis-ROS’ and ‘mitophagy’ pathways showed significant enrichments in childhood AD with high prenatal PM2.5 exposure in both the placenta and cord blood. Finally, this study identified five core genes (COX4I1, COX7B, NDUFA1, NDUFB1, and UBA52) in the placenta and two core genes (BNIP3 and CXCL8) in the cord blood that are strongly linked to prenatal PM2.5 exposure and lead to a higher risk of AD development. Conclusion: Exposure to PM2.5 during pregnancy, especially the first trimester of gestation, affects the risk of AD. Chemical carcinogenesis-ROS, mitophagy, and NF-κB signaling pathways through DEGs of the placenta and cord blood may be involved in the mechanism of the development of childhood AD via the regulation of the immune responses in response to prenatal PM2.5 exposure.

통합적인 암 유전체 분석을 통한 새로운 임상적 의미 및 잠재적인 치료 타겟 발굴

Sat, 31 Dec 2022 15:00:00 GMT

Title: 통합적인 암 유전체 분석을 통한 새로운 임상적 의미 및 잠재적인 치료 타겟 발굴 Author(s): 오지혜 Abstract: 지금까지 암 유전체학 연구를 통해 암 환자의 유전체 데이터를 이용하여 암의 발달과 진행을 이끄는 수많은 유전변이가 발견되었다. 이러한 연구들은 암 생물학에 대한 우리의 식견을 극도로 넓히며 암 맞춤의료, 정밀의료의 지평을 열었다. 하지만 여전히 특정 암종에서 치료 효용성이 있는 약물 부재, 정상세포에서의 체세포 돌연변이에 관한 연구 부재 등 반드시 해결해야 할 몇 가지 문제들이 있다. 이에 본 연구에서는 암 유전체학에서의 연구 수요를 바탕으로 다음의 두 가지 연구 주제를 선정하였다. 첫째는 간세포암에서 치료 효용성이 있는 표적과 약물을 찾는 것이고, 둘째는 분석할 수 있는 모든 암종을 대상으로 암 환자의 암 주변 정상 시료와 암 시료에 존재하는 체세포 돌연변이를 찾고 이들의 관계에 대해 밝히는 것이다. 앞서 제시한 첫 번째 문제를 해결하기 위해서 2장에서는 592명의 다인종 간세포암 환자로부터 유래된 전장 엑솜 유전체, 전사체 데이터 세트를 이용하였다. 또한 공개된 간세포암 세포주에 대해 인실리코 및 인비트로 방식으로 상동 재조합 유전자의 돌연변이를 표적으로 하는 약물의 반응성을 평가하였다. 연구 결과 상동 재조합 유전자에 특정 돌연변이가 있는 환자의 경우 더 낮은 무진행 생존율과 독립적으로 관련이 있었으며 이들은 증식 및 복제 관련 유전자가 상향조절 되어있었고 높은 가족력과 관련이 있었다. 또한, 이러한 상동 재조합 유전자 돌연변이 표현형을 가지는 간세포암 세포주에 폴리(ADP-리보오스) 중합효소 억제제를 처리하였을 때 세포가 사멸되는 현상을 관찰하였다. 본 논문의 3장에서는 앞서 제시한 두 번째 문제를 해결하기 위해서 10개 종양 유형에 대한 혈액 시료를 기반으로 392명의 환자의 종양 및 정상 조직 쌍에서 체세포 돌연변이를 분석하였다. 또한, 본 분석에서 사용한 모든 유전체 데이터는 공개된 전장 엑솜 유전체 데이터를 이용하여 수행되었다. 정상 조직에서 발생한 체세포 돌연변이를 대상으로 분석한 결과 해당 돌연변이들은 노화와 밀접한 관련이 있었으며 PI3K, NOTCH 및 TP53과 같은 발암 경로와 관련된 돌연변이도 확인되었다. 이러한 변이들은 10개 종양 조직 간에는 거의 겹치지 않는 것으로 보아 조직 특이적인 변이 특성이 있는 것으로 생각된다. 흥미로운 것은, 정상 종양 조직과 일치하는 종양 조직 간에는 서로 공유되는 체세포 변이가 발견되었다는 점이다. 공유되는 변이의 특성을 살펴본 결과, 공유되지 않는 변이와 비교할 때 높은 빈도로 고병원성 변이에 해당했으며, 더 높은 대립유전자 빈도를 나타냈다. 마지막으로 본 연구에서는 6개의 정상 조직에서 PIK3CA 돌연변이를 발견했고, 해당 환자의 일치하는 모든 암 조직에서도 PIK3CA 돌연변이를 발견했다. 6명의 환자 중 4명에서 정상 조직 및 암 조직에서 동일하게 공유되는 PIK3CA 돌연변이가 확인되었는데 이는 이 돌연변이가 암 발달과정과 연관이 있음을 의미한다. 종합하면 2-3장에서 제시한 연구 결과는 간세포암에서 상동 재조합 유전자 결함이 환자의 예후와 합성 치사 약물의 표적으로 이용될 수 있다는 가능성을 확인한 것과 체세포 돌연변이 클론이 정상 조직에 존재하고 그들의 클론 확장이 암 발달과 연관될 수 있음을 밝힌 것에 의의가 있다. To date, cancer genomics have revealed numerous alterations that drive the development and progression of cancer. Previous studies have extremely improved our understanding of the cancer biology, and these have led to new methods to diagnose and treat cancer. However, there are still unsolved problems, such as the absence of treatment options for specific cancer types, and acquired mutations in normal tissue adjacent to the tumor tissue. In this study, we addressed two unsolved problems, as follows; 1) A therapeutic strategy is still needed for hepatocellular carcinoma (HCC). 2) Somatic mutations are a major driver of cancer development and many of these have now been identified in various cancer types, but the somatic mutation status of the normal tissues matched with tumors has not been comprehensively revealed. To solve the first problem, in chapter 2, we used a merged whole exome or RNA sequencing dataset derived from in-house and TCGA databases of multiethnic HCC samples. We also evaluated synthetic lethal approaches targeting mutations in homologous recombination (HR)-associated genes using HCC cells selected from five public-access genomic databases of human cancer cell lines. Samples harboring pathogenic germline variants (PGVs) in HR were found to be independently associated with poor disease-free survival after HCC resection. They were also significantly associated with the upregulation of proliferation and replication-related genes, and a familial risk of HCC. Pharmacologic experiments with HCC cells defective in two different HR pathway genes showed that in tumors, this phenotype is synthetic lethal with poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. In chapter 3, for the second problem, we analyzed somatic mutations from whole exome sequencing data of 392 patient tumor and normal tissue pairs based on the corresponding blood samples across 10 tumor types. Many mutations involved in oncogenic pathways such as PI3K, NOTCH, and TP53, were identified in the normal tissues. Further, the aging-related mutational signature was the most prominent contributing signature found, and the mutations in the normal tissues were frequently affected genes involved in the late replication time. Variants were rarely overlapping across tissue types but shared variants between normal and matched tumor tissues were present. These shared variants were frequently pathogenic when compared with non-shared variants and showed a higher variant allele fraction. PIK3CA mutations were identified in six normal tissues, and these were also present in all of the matched cancer tissues. The most important finding was that four of six patients had the same mutations in normal and matched cancer tissues. This finding suggest that the mutations could be linked to cancer development processes. Collectively, in chapter 2-3, our findings suggest that 1) germline HR defects in HCC tend to confer a poor prognosis and are a possible synthetic lethal target, and 2) somatic mutant clones exist in normal tissues and that their clonal expansion could be linked to cancer development.

CRISPR 염기 교정 기술 기반의 환자유래 돌연변이 분석 연구

Sat, 31 Dec 2022 15:00:00 GMT

Title: CRISPR 염기 교정 기술 기반의 환자유래 돌연변이 분석 연구 Author(s): 시지은 Abstract: Functional characterization of genetic variants provides clinically critical aspect in uncovering and prevention of the cancer development. Since BRCA1 and BRCA2 (BRCA1/2) genes are essential for maintaining genome integrity and controlling multiple DNA repair processes, pathogenic genomic mutations in BRCA1/2 increased risk of tumor development such as breast, ovarian and pancreatic cancers. Since there are many BRCA1/2 mutations interpreted as variants of uncertain significance (VUS), it is necessary to evaluate the functionality of these mutations to identify their pathogenicity. In the past decades, although various efforts have been made to assess the BRCA1/2 VUSs, these strategies have unsolved problems such as that they are not in a native genomic context and downstream regulations are affected by overexpression of cDNAs. Recently, several groups showed that CRISPR-Cas9 based genome editing tools enable introduced genetic mutations at the endogenous BRCA1/2 genes and they developed CRISPR-based high-throughput genetic screens for functional assessment of BRCA1/2 VUSs. Although the results of CRISPR-based screens provide a lot of information for functionalities of BRCA1/2 variants, there are also several problems including limited target locus according to the PAM sequences of Cas9 and unintentional presence of false positives and negatives. Therefore, accurate methods to verify the function of BRCA1/2 is needed to overcome these limitations. In this thesis, I have developed a precise method for individual validation of BRCA VUSs using improved CRISPR-dependent base editors. To enable the introduction of more diverse BRCA1/2 mutations, we expanded the target range by constructing cell lines stably expressing base editors without restriction of PAM sequences. In addition, the constructed cell lines showed improved base editing efficiency compared to the traditional method of delivering the base editor and gRNA together, and cell viability changes over time were clearly identified. PAMless base editor cell lines are valuable as a novel functional assessment method that complements the shortcomings of previous strategies because they can efficiently introduce various BRCA1/2 mutations independently of PAM sequences without causing DNA double strand breaks and without donor DNA templates. To verify the functional assessment method of BRCA1/2 variants using the constructed cell lines, it was applied to BRCA1/2 mutations whose interpretation was clearly identified in the ClinVar database. Cell viability gradually decreased when the BRCA pathogenic mutation was introduced, whereas it was maintained when the benign mutation was introduced, confirming the feasibility of functional assessment using the constructed cell line. Furthermore, we applied this functional assessment system to 44 patients-derived BRCA1/2 VUSs from National cancer center (NCC) in South Korea and classified the variants into Benign/Likely benign or Pathogenic/Likely pathogenic. Interestingly, among patients-derived VUSs, the BRCA1 L52F mutation showed olaparib sensitivity, which reduced cell viability only when treated with olaparib. Olaparib sensitivity was confirmed when the BRCA1 I26A mutation, known to specifically disrupt E2 ubiquitin activity without affecting heterodimer formation with BARD1, was introduced. Even when the L52P mutation, which is listed as VUS in ClinVar database, was introduced into the Leu52 residue, olaparib sensitivity was shown. Off-targets of each mutation were selected and analyzed, and it was confirmed that olaparib sensitivity was not caused by off-targets. We reasoned that, since the Leu52 residue is located at the E2-binding interface, the mutation affects ubiquitination, leading to olaparib sensitivity. In that a specific mutation can be a druggable target, this phenomenon can be used in various ways, and further research is needed.