중간엽 줄기세포를 이용한 간세포 분화와 치료기전 연구

Abstract

The liver plays a critical role in the human body, such as detoxification, synthesis, and metabolism. Unfortunately, many people suffer from liver diseases, and the number was increased every year. Recently, stem cell technologies were advanced, and stem cells are expected to replace liver transplantation in the future. Particularly, Mesenchymal stem cells (MSCs) are in the spotlight for cell therapy. At the beginning of this study, we determined one MSC line that was appropriated for cell therapy and hepatic differentiation through several experiments, such as a measurement of cell size, pluripotency, immunomodulation, and mitochondrial function. As a result, amnion-derived mesenchymal stem cells (AM-MSCs) are a great source of stem cell therapy for patients with liver diseases. However, there are obstacles to their use due to low efficiency and xeno-contamination for hepatic differentiation. Thus, we established an efficient protocol for differentiating AM-MSCs into hepatocyte-like cells (HLCs) by analyzing transcriptome-sequencing data. In AM-MSCs, hepatic development-associated genes, including GATA6, EGF, AFP, and FGF2 were downregulated, and GSK3 was upregulated. The high levels of GSK3 could repress the induction of hepatocytes. Based on this result, we established an efficient hepatic differentiation protocol using the GSK3 inhibitor, CHIR99021, with various supplements. Moreover, to generate the xeno-free conditioned differentiation protocol, we replaced fetal bovine serum (FBS) with polyvinyl alcohol (PVA). As a result, PVA was improved differentiation ability, such as upregulation of hepatic progenitor, hepatocyte-related, and metabolism markers. Finally, we measured the hepatocyte functions with the expression of gene levels and protein, secretion of albumin, and activity of CYP3A4. The differentiated HLCs not only synthesized and secreted albumin but also metabolized drugs by the CYP3A4 enzyme. Further, to test the transplantable potential of AM-HLCs, we optimized a transplantation date, 12 days after initiation of differentiation, based on the expression of hepatic progenitor gene and mitochondrial function. Finally, we established a mouse model of acute liver failure using a thioacetamide (TAA) and cyclophosphamide monohydrate (CTX) and transplanted AM-hepatic progenitors (HPCs) in the mouse model through splenic injection. When the AM-HPCs were transplanted into the liver failure mouse model, they settled in the damaged livers and differentiated into hepatocytes. This study offers an efficient and xeno-free conditioned hepatic differentiation protocol and shows that AM-HPCs could be used as transplantable therapeutic materials. Thus, we suggest that AM-MSC-derived HPCs are promising cells for treating liver disease. |간은 사람 신체 내에서 중심에 자리 잡고 있으며, 약물, 화학물의 분해와 외부에서 들어오는 독성을 해독하며, 몸에 필요한 다양한 물질을 합성하는 중요한 장기이다. 오늘 날, 미국에서만 10 만명 이상의 간질환 환자가 발생하고 있으며, 그 중 12,000 명이 매년 간질환으로 인해 사망한다고 하며, 한국에서도 2018 년도 통계에 따르면 간질환으로 사망한 사람의 수가 전체 사망자 수의 7 위에 해당한다고 한다. 이렇게 간질환으로 인해 사망하는 사람의 수가 많은 이유는 심각한 간 질환을 가진 환자들의 대부분의 치료법으로 간 이식을 통해서만 병을 치료할 수 있기 때문이다. 하지만 이식할 수 있는 간 조직의 공급은 수요에 비해 부족하며, 장기 이식 후 나타나는 다양한 거부 반응, 이식 후 면역 억제제 복용에 따른 부작용 등으로 인해 이식 수술을 대체할 재생 치료제의 개발 필요성이 대두되고 있다. 최근 줄기세포를 이용한 치료 기술의 발전으로 인해 줄기세포를 이용한 치료법 개발이 활발히 일어나고 있으며, 다양한 조직에서 유래한 줄기세포를 원하는 조직 세포 (피부, 연골, 심장세포 등)로 분화하여 이를 치료제로 사용하려는 세포 치료제 연구가 진행되고 있다. 특히, 만능줄기세포 (human induced pluripotent stem cells, hiPSC)와 배아 줄기세포 (human embryonic stem cells, hESC) 등을 이용하여 연구가 진행 중이지만, 이는 체내로 들어갔을 때, 암화가 진행 될 수 있으며, 이를 조절할 수 없기에 안정성이 떨어진다는 연구결과가 나오고 있다. 따라서 현재 안정성이 검증된 태아 혹은 성체 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSC)을 추출하여 필요한 조직으로 유도하고 이식하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에선 태아에서 얻을 수 있는 제대혈과 양막 유래 줄기세포와 성체에서 얻을 수 있는 골수와 간조직 유래 줄기세포를 추출하여 세포의 크기, 분화능력, 면역조절 작용, 미토콘드리아 기능 검사 등을 진행하여 각 유래 별 줄기세포의 특징을 연구하였다. 또한 세포 치료를 위해선 다량의 세포를 확보 하는게 중요한데, 양막 유래 줄기세포는 다량으로 배양할 수 있는 특징을 가지고 있으므로 여기에 잘 들어 맞는 세포임을 밝혔다. 다음으로 이러한 특징들을 종합하여 세포 치료에 가장 유능할 것이라고 생각되어지는 양막 유래 줄기세포를 선택하여 간세포로의 분화를 진행하였다. 특히 본 연구에선 transcriptome 분석을 통해 양막 유래 줄기세포의 유전체 발현 정도를 분석하였다. 양막 유래 줄기세포엔 GATA 6의 발현이 낮으며, GSK3의 발현이 높아 간세포로 분화가 어려워, CHIR99021이라는 화학물질을 첨가하여 간세포로의 분화 효율을 올렸다. 특히, 폴리 비닐 알코올 (PVA)라는 이용, 그동안 많은 간 분화를 위해 사용했던 FBS를 대신하여 PVA를 분화에 사용함으로써, 외부 물질이 오염되지 않고 효율적으로 양막 줄기세포를 간세포로 분화할 수 있는 간 분화 프로토콜을 적립하였다. 또한 이 간세포가 알부민을 합성하여 외부로 분비하며, 몸에서 중요한 간 특이 효소로 외부 항원을 분해 한다고 알려진 CYP3A4가 발현하고 활성이 된다는 것도 실험을 통하여 밝혔다. 마지막으로 본 연구에선 안정적인 간질환 마우스 모델을 확립하여 양막 줄기세포에서 분화된 간세포를 이식하고, 치료 효과와 이식 효율 등을 실험하여 성공적으로 양막 줄기세포 유래 간세포가 간질화 마우스 모델에 이식되는 것을 확인하였다. 본 연구는 세포 치료에 유망할 것이라고 생각되어지는 양막 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 간 분화를 진행하였다. 또한 줄기세포의 유전체 분석을 통해 같은 장기의 줄기세포 유래임에도 조금씩 다른 세포 내 기전이 있다는 것을 밝혔다. 또한 유전체 분석을 통해 새롭게 적립한 효율적이고 외부 항원 감염이 없는 간세포 분화 방법을 적립하여 기능이 존재하는 간세포를 줄기세포로부터 분화하였다. 마지막으로 간세포가 임상학적으로 사용될 수 있는 가능성을 간 질환 동물 모델을 통해 전임상학적으로 제시하였다. 따라서 기능이 있고 이식이 가능한 줄기세포 유래 간 세포 분화 방법을 연구함으로써 앞으로의 간질환 환자의 세포 치료에 일조하고자 하였다.