MRL/MpJ-Faslpr/J 마우스를 이용한 조기 루푸스 신염의 소변 바이오마커 발굴

Abstract

Abstract Background. Lupus nephritis (LN) is systemic lupus erythematosus (SLE) with kidney injury. The prognosis of LN remains poor if proper treatment is not provided in the early stage of LN. However, there are patients of early staged LN who are limited to renal biopsy, such as patients with normal proteinuria. Therefore, non-invasive biomarkers for early stages of LN are needed. Objective. To discovery urine biomarker candidates and evaluate the usefulness of the candidates as biomarkers for early detection of LN. Methods. Using SWATH LC-MS analysis, we found urine biomarker candidates that differentiate early-stage LN from SLE patients without nephritis. The candidates were measured in the urine of MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) mice at 13 and 23 weeks. Hematoxylin and eosin (H&E), periodic acid-Schiff (PAS) and Masson Trichrome staining (MT) was performed on the kidney of 23-week-old mice for histological examination. The expression of ORM1 and SERPINC1 of the kidney was confirmed by immunofluorescence staining. Results. Urine ORM1, SERPINC1, Transferrin and albumin were elevated in SLE patients with newly diagnosed LN compared with SLE patients without LN. Levels of urine SERPINC1 and ORM1 were also significantly higher in MRL/lpr mice than in MRL/MpJ mice at 13 and 23 weeks. In contrast, a considerable difference in urine transferrin and albumin between the two groups was only observed at 23 weeks, not at 13 weeks. Regarding the kidney pathology of MRL/lpr mice, urine ORM1 and albumin, but not urine SERPINC1, were positively correlated with the activity index and chronicity index. Conclusions. We propose that urine SERPINC1 and ORM1 are novel biomarkers to detect early-stage LN. Additionally, we suggest that urine ORM1 could be useful for prediction of kidney chronicity and activity index in suspected LN patients that are limited to kidney biopsy. Keywords: Lupus nephritis, Systemic lupus erythematosus, Biomarker, Proteome analysis, Serpin family C member 1 (SERPINC1), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), Transferrin (TF), Interleukins |국문요약 전신홍반루푸스는 젊은 여성에게 빈번하게 발생하는 자가 면역 질환 중 하나로 주로 루푸스 발생 5년 이내에 신장 손상이 발생하는데 이를 루푸스 신염이라 한다. 루푸스 신염의 진단방법에는 소변검사와 신생검이 있으나, 소변 검사는 신체적 활동과 소변을 모으는 시기에 따라 결과가 달라질 수 있기 때문에 정확한 진단은 신생검을 통해 이루어지고 있다. 그러나 신생검은 높은 검사비용, 출혈 등의 합병증의 위험이 있고, 일부 환자의 경우, 신염의 주요 증상 중 하나인 단백뇨가 충분히 나타나지 않는 경우가 있어 신생검을 진행하기에 어려운 경우가 있다. 루푸스 신염은 초기의 치료가 중요한 만큼 유의한 단백뇨가 나타나지 않는 초기 환자에서 진단에 필요한 신생검을 시행할 수 있는 근거를 마련하기 위해 비침습적 샘플인 소변 유래 바이오마커 발굴이 필요한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 비침습적 샘플인 루푸스 환자의 소변샘플에서 신염 예측 가능한 바이오 마커 후보군을 발굴하고 루푸스 신염의 마우스 모델인 MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) 마우스 소변에서 또한 그들의 유용성을 확인하였다. 본 연구에서는 정상인과 환자 소변의 SWATH LC-MS 분석을 통해 루푸스 신염 환자의 신염발생 예측 가능한 소변 바이오 마커의 후보 단백질들을 도출하였고 이 후보 바이오마커들을 13주와 23주령 MRL/lpr 마우스 소변에서 또한 재확인하였다. 조직학적 분석을 위해 23주령 마우스 신장을 헤마톡실린&에오신 (H&E), Masson’s Trichome (MT), 과옥소산시프 (PAS) 염색법으로 조직 염색하여 신장질병의 활성도와 만성 정도를 평가하였다. 또한, 23주령 마우스 신장에서 면역 형광 염색으로 ORM1과 SERPINC1을 염색하여 단백질 발현 정도를 측정하였다. 연구결과, 환자의 소변 단백질 분석에서 전신홍반루푸스 환자의 소변에 비해 진단 초기 루푸스 신염 환자의 소변에서 ORM1, SERPINC1, Transferrin가 유의적으로 증가되어 있음을 확인하였고, 이들을 소변 바이오마커 후보군으로 선정하였다. 이후 루푸스 마우스 소변에서는 ORM1과 SERPINC1이 Transferrin, 알부민과 달리 13주 MRL/lpr 마우스 소변에서 유의적으로 증가된 것을 확인하였다. 마우스 신장 조직 분석결과 또한, 소변 ORM1과 알부민은 activity index, chronicity index와 양의 상관관계가 있음을 확인하였다. 따라서, 루푸스 신염의 조기 발견을 위한 소변 바이오마커로서 ORM1과 SERPINC1을 제안하며, 신장 조직 검사가 어려운 신염 의심 환자에서 소변 ORM1 측정이 진단 및 조직 만성도와 활성도 예측에 도움을 줄 것으로 사료된다.