Investigation of the genes associated with VSIG4-mediated T cell inhibition using genome-wide CRISPR knockout screenings

Abstract

The blockade of immune checkpoint molecules that suppress T cell activation has demonstrated improved therapeutic efficacy, durable response, and safety. However, the limited therapeutic efficacy and the low response rates of these immunotherapies in various types of cancer have motivated us to explore new immune checkpoint molecules. VSIG4, a novel immune checkpoint molecule, suppresses T cell activity and promotes the differentiation of regulatory T cells. Its expression indicates a significant correlation with age-related immune diseases and is strongly associated with the prognosis of gastric cancer and lymphoma. Although it has therapeutic potential, the T cell inhibition mechanism of VSIG4 has not been comprehensively understood so far. Here, we investigated the VSIG4 signaling pathway that inhibited T cell activation by the genome-wide CRISPR knockout screening, based on the CD69 induction, a well-known marker for T cell activation. Our results showed that VSIG4 can regulate ribosomal RNA processing, CD5 signaling pathway, and S1PR1 signaling pathway for the regulation of T cell activation. These mechanisms are known to be associated with regulating the signal strength of T cell receptors, the differentiation of regulatory T cells, and the activation of T cells. Our results provide the basis for developing therapeutic approaches for age-related immune diseases, gastric cancer, and lymphoma. The distinct T cell inhibition mechanism of VSIG4 will meet the unmet needs of patients who did not respond to conventional immune checkpoint blockade therapy.|T세포의 활성을 조절하는 면역관문 분자(immune checkpoint molecule)를 표적으로 하는 면역치료제(immune checkpoint blockade)는 치료 효과의 높은 지속성(durability)과 안전성(stability)으로 암 치료효과의 획기적인 도약을 이루어 냈다. 그러나 낮은 치료 반응성과 암종별 제한적인 효과를 보여주고 있어, 이를 극복하기 위한 새로운 면역치료제의 개발이 시급하다. VSIG4는 T 세포의 활성을 억제하고 조절 T 세포(regulatory T cells)로의 분화를 촉진하는 새로운 면역관문 조절자로, VSIG4의 발현이 위암과 림프종(lymphoma) 환자의 예후뿐만 아니라 노화성 면역질환과 밀접한 연관성을 갖고 있어, 새로운 면역 치료제의 개발 후보로 많은 관심을 받고 있다. 이러한 잠재력에도 불구하고, 현재까지 VSIG4의 T cell inhibition mechanism은 제대로 밝혀지지 않았다. 본 실험은 새로운 면역치료제 개발 기반 제공을 위해 VSIG4의 T 세포 활성 억제 신호기전을 genome-wide CRISPR screening을 통해 밝혀냈다. 우선, T 세포의 초기 활성화 마커(marker)인 CD69의 증감을 통해 T 세포의 활성 및 VSIG4를 통한 활성 억제를 평가할 수 있는 시험관 내(in vitro) 모델을 구축했다. 해당 모델에 genome-wide CRISPR knockout library를 삽입 한 후, CD69증가 세포군과 CD69감소 세포군을 분리(순도 >95%)하고, 각 세포군의 genomic DNA에서 guide count를 NGS를 통해 분석했다. MAGeCK-Robust Rank Aggregation을 통해 유의미한 sgRNA의 변화를 분석(p <0.05, FDR <0.25)하여 VSIG4의 T 세포 활성 억제 기전 유전자 후보들을 도출하였다. Reactome과 String 분석을 통해, VSIG4가 ribosomal RNA processing과 CD5 pathway, S1PR1 pathway를 조절하여 T 세포의 활성을 억제함을 확인했다. 이 기전들은 T 세포 수용체(receptor)의 신호강도를 조절, 조절 T 세포의 분화, T 세포의 활성화 등이 연관되어 있음이 밝혀져 있다. 본 실험으로 밝혀진 VSIG4의 T 세포 활성 억제기전을 통해 한국인에서 높게 발생되는 위암과 림프종의 치료제 개발의 기반을 제공할 수 있다. 또한, VSIG4는 기존 면역치료제와는 다른 신호기전을 통해 T세포의 활성을 억제하기 때문에 기존 면역치료제와의 병용치료를 통해 치료반응성을 크게 향상시키는 새로운 치료전략을 개발할 수 있다.