CRISPR-매개 염기 편집 개선을 위한 소분자 약물 스크리닝

Abstract

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system, which was originally designed as an adaptive immune system to defend against viral genomes, is now more commonly known as a genome editing tool termed RNA-guide engineered nucleases (RGENs). The mechanism of the CRISPR-Cas9 system is that Cas9 protein and gRNA form a complex, recognize a target DNA sequence, and induce a DNA double-strand break (DSBs). Cleaved DNA is repaired through an intracellular DNA repair pathway, non-homologous end joining (NHEJ), or homology-directed repair (HDR). NHEJ induces gene disruption through small insertions and deletions, whereas HDR induces homologous recombination in the presence of a donor template, thus assisting with gene correction and insertion. Recently, CRISPR-based genome editing has applications in a variety of fields, including agriculture, drug discovery, medicine, and biotechnology. Especially it is attracting attention as a promising tool to treat disease, and clinical trial development is currently accelerating. However, despite having enormous potential for treating disease, there are several problems. Recently, p53-mediated toxicity, large chromosomal deletions and rearrangements, and the occurrence of unwanted byproducts and indels caused by DSBs caused by Cas9-based genome editing have been continuously reported. In addition, since many pathogenic genetic diseases are caused by point mutations, Cas9 nuclease-based disease-related mutation correction is inefficient and has safety issues. In this manner, an approach to precisely correct the target base was required, prompting the development of a base editor capable of correcting the base without DSBs. Base editors currently have two major types, cytosine base editor (CBE) and adenine base editor (ABE). CBE fused with cytidine deaminase to nCas9 (nickase Cas9, catalytically inactive D10A mutation) induces C:G to T:A conversion and ABE fused with adenine deaminase to nCas9 induces A:T to G:C conversion. The present generation of base editors has evolved and refined to optimize efficiency; however, their activity is highly variable depending on cell type and target sequences. Previous studies have demonstrated an attempt to improve the efficiency of the base editor. Notably, the efficiency of CBE was improved by fusing uracil glycosylase inhibitor (UGI) which inhibits the activity of uracil N-glycosylase (UNG). Therefore, this study aimed to investigate the effect of inhibition of certain endogenous protein functions of base editors. To inhibit certain protein functions, small molecule drugs have been adopted, and these strategies have been used to improve the efficiency of Cas9-based genome editing but have not been investigated in base editors. In this study, a fluorescence-based reporter system was developed to identify novel small molecules. 414 small molecule drug libraries were screened in the HAP1 cell line, which was integrated with a reporter system, and histone deacetylase (HDAC) inhibitors were ranked high. Romidepsin with the highest-ranking increased adenine base editing efficiency up to 3.8-fold at the endogenous target sites. These effects verified that romidepsin enhances the expression levels of ABE7.10 protein and gRNA. Additionally, HDAC inhibitors can convert euchromatin through histone hyperacetylation. To evaluate the effect of chromatin status on base editing efficiency, ABE7.10 ribonucleoprotein (RNP), a complex of purified ABE7.10 protein and gRNA that excludes expression-enhancing effect, was electroporated, and romidepsin increased the adenine base editor efficiency up to 4.9-fold. These results suggest that chromatin was converted to an open state throughout the ChIP assay, leading to improved adenine base editing efficiency due to improved RNP accessibility. In conclusion, the HDAC inhibitor can increase the efficiency of CRISPR-mediated base editing based on enhanced expression and improved RNP accessibility. These results may provide insights into further studies to improve the efficiency of CRISPR-mediated genome editing and support strategies to increase the efficiency of in vivo genome editing in therapeutic applications. |Clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) 시스템은 원래 바이러스 게놈을 방어하기 위한 적응 면역 시스템으로 설계되었으며, 이제는 RNA-guide engineered nuclease (RGENs)으로 불리는 게놈 편집 도구로 더 잘 알려져 있다. CRISPR-Cas9 시스템의 기작은 Cas9 단백질과 gRNA가 복합체를 형성하여 표적 DNA 서열을 인식하고 DNA의 이중 가닥 손상 (DSB, double strand break)을 한다. 절단된 DNA는 세포 내 DNA 복구 경로인 비상동말단연결 (NHEJ. Non-homologous end joining) 또는 상동성 유도 복구 (HDR, Homology-directed repair)를 통해 복구된다. NHEJ는 작은 삽입과 결실을 통해 유전자 파괴를 유도하는 반면 HDR은 기증자 주형의 존재 하에서 상동 재조합을 유도하여 유전자 수정과 삽입을 돕는다. 최근 CRISPR 기반 게놈 편집은 농업, 신약 개발, 의학, 생명 공학 등 다양한 분야에서 응용되고 있다. 특히 질병을 치료하는 유망한 도구로 주목받고 있으며 현재 임상시험을 위한 개발이 가속화되고 있다. 이러한 CRISPR 기술이 질병을 치료할 수 있는 큰 잠재력을 가짐에도 불구하고 몇 가지 우려되는 문제가 있다. 최근에는 Cas9 기반 게놈 편집에 따른 DSB에 의해 p53 매개 세포 독성, 대규모 염색체 결실 및 재배열, 원하지 않는 부산물 및 인델 (Indel, insertion and deletion)의 발생이 지속적으로 보고되고 있다. 또한 많은 병원성 유전 질환이 점 돌연변이에 의해 발생하기 때문에 Cas9 뉴클레아제를 기반으로 한 유전 질환 관련 돌연변이 교정은 비효율적이며 안전성 문제가 있다. 이와 같이 표적 염기를 정밀하게 교정하는 전략을 필요로 했고 DSB 없이 염기를 교정할 수 있는 염기 편집기 (BE, base editor)의 개발이 요구되었다. 염기 편집기는 현재 사이토신 기본 편집기 (CBE, cytosine base editor)와 아데닌 기본 편집기 (ABE, adenine base editor)의 두 가지 유형이 있다. nCas9에 시토신 탈아미노화효소 (cytidine deaminase) 와 융합된 CBE (nickase Cas9, 촉매적으로 불활성인 D10A 돌연변이)는 C:G에서 T:A로의 전환을 유도하고, ABE는 nCas9에 대한 아데닌 탈아미노화효소 (adenine deaminase)와 융합되어 A:T에서 G:C로의 전환을 유도한다. 현재 세대의 염기 편집기는 효율성을 최적화하기 위해 진화하고 개선되었지만 그 활동은 세포 유형 및 대상 시퀀스에 따라 매우 다양하다. 이전 연구에서는 염기 편집기의 효율성을 개선하기 위한 여러 노력들이 있었다. 특히, 우라실 N-글리코실라아제 (UNG, uracil DNA glycosylase )의 활성을 억제하는 우라실 글리코실라아제 억제제 (UGI, uracil DNA glycosylase inhibitor)를 융합하여 CBE의 효율이 개선되었다. 따라서 본 연구에서는 특정 내인성 단백질 기능 억제가 염기 편집기에 미치는 효과를 조사하고자 하였다. 특정 단백질 기능을 억제하기 위해 소분자 약물이 적용되었으며 이러한 전략은 Cas9 기반 게놈 편집의 효율성을 향상시키는 데 사용되었지만 아직까지는 염기 편집기에서는 그 효과가 조사되지 않았다. 따라서 이 연구에서는 염기 편집기 효율성에 영향을 미치는 새로운 소분자를 식별하기 위해 형광 기반 리포터 시스템을 개발했다. 리포터 시스템이 통합된 HAP1 세포주에서 항암 특성을 가진 414개의 소분자 약물 라이브러리를 스크리닝 했고, 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC, Histone deacetylase) 억제제가 높은 순위에 기록되었다. 순위가 가장 높은 로미뎁신은 내인성 표적 부위에서 아데닌 염기 편집 효율을 최대 3.8배까지 증가시켰다. 이러한 효과는 로미뎁신이 ABE7.10 단백질 및 gRNA의 발현 수준의 향상에 기여함을 확인하였다. 또한 HDAC 억제제는 히스톤 과아세틸화를 통해 열린 염색질 상태로 전환시킬 수 있다. 따라서 ABE7.10의 접근성이 향상되었을 거라 추측했고, 발현 강화 효과를 배제하기 위해 정제된 ABE7.10 단백질-gRNA 복합체인 RNP (ribonucleoprotein)을 전기 천공 후 로미뎁신을 처리했을 때 염기 편집 효율이 최대 4.9배 증가했다. 이러한 결과는 ChIP 분석에 의해 염색질이 열린 상태로 전환됨에 따라 RNP 접근성 향상에 의해 염기 편집 효율이 향상되었음을 시사한다. 결론적으로 HDAC 억제제는 개선된 발현 및 향상된 RNP 접근성을 기반으로 CRISPR 매개 염기 편집의 효율성을 높일 수 있다. 또한 이러한 결과는 CRISPR 매개 게놈 편집의 효율성을 개선하기 위한 추가 연구에 대한 통찰력을 제공하고, 치료 응용 분야에서 생체 내 게놈 편집의 효율성을 높이기 위한 전략을 지원할 수 있다.