유도만능줄기세포 유래 인슐린 생성세포 클러스터의 동결보존법에 대한 연구

Abstract

Type 1 diabetes, resulting from autoimmune destruction of beta cells, challenges regulating blood glucose due to diminished beta cell functionality. Islet cell transplantation offers a promising solution, yet the limited islet cell supply hinders widespread application. To overcome this limitation, induced pluripotent stem cells (iPS) have been investigated as a source of islet cells. iPS cells can be differentiated into insulin-producing cells (IPCs) that are similar to native islets. However, IPCs from iPS cells need to be cryopreserved for long-term storage. The slow freezing method using the controlled rate freezer allows for the adjustment of freezing rate and time. A freezing rate slower than -1°C/min provides sufficient equilibration time for the cryoprotective agent (CPA) to be uniformly supplied to the cell interior, preventing crystal formation and minimizing cell damage. The investigation involves slow freezing with a CPA containing trehalose in dimethyl sulfoxide (DMSO). Initial experiments on human islets establish cryopreservation conditions, which are then applied to iPSC-derived IPCs for viability and functionality assessments. Experimental groups include conventional freezing, slow freezing with CRF, and CRF slow freezing with trehalose-added CPA. The research findings indicate that iPS-derived IPCs, when frozen using the CRF method and subsequently thawed, maintained over 80% viability even after three days or more long-term preservation. Moreover, post-differentiation, the presence of the IPC differentiation marker, c-peptide, was confirmed to be above 17%, demonstrating the sustained differentiation capability of the clusters after thawing. Additionally, it was observed that transitioning from 2D differentiation to 3D cluster formation at the pancreatic progenitor stage during iPS differentiation resulted in enhanced functionality post-differentiation. These results indicate that iPS-derived IPC clusters can be successfully frozen using the slow freezing method, allowing for long-term preservation. Further optimization of CRF could improve the efficiency of cryopreservation and increase the clinical potential of iPS-derived IPCs for islet transplantation.|제1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨병으로, 일반적으로 인슐린 투여나 췌도세포 이식을 통해 혈당을 조절하고 합병증을 예방한다. 췌도세포 이식은 한 번의 수술로 장기적인 혈당 조절이 가능하므로, 주기적인 인슐린 투여가 필요한 만성 당뇨 환자들의 삶의 질을 향상시키고 합병증 발생 위험을 줄일 수 있다. 그러나, 췌도세포는 공급이 한정적이라는 한계가 있다. 이러한 한계를 극복하기 위한 대안으로 줄기세포를 분화하여 췌도세포의 공급원으로 사용되는 방법이 많이 연구되고 있다. 특히 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS)는 당뇨병 치료에 효과적인 인슐린 생성 세포(insulin producing cell, IPC)로 분화될 수 있다. 그러나 이 분화 과정에는 최소 3주가 소요되며, 추가적인 품질평가 과정을 고려한다면 분화된 iPS 유래 인슐린 IPC를 장기보관 하기 위한 동결보존법이 필요하다. 자동 세포 동결 장비(controlled rate freezing, CRF)를 사용한 완만 동결 방법은 동결 속도와 시간을 조절할 수 있게 해준다. -1°C/min 이하의 동결 속도는 세포 동결 시 동결보호제가 세포 내부에 균일하게 공급될 수 있는 평형시간을 주어 결정 형성을 방지하고 세포 손상을 최소화한다. CRF 장비를 이용하면 세포의 군집인 클러스터 형태인 IPC 클러스터를 효율적인 동결보존이 가능할 것으로 예상하였다. 본 실험을 진행하기 전에, 췌도세포를 사용한 사전 실험을 통해 동결보존 조건을 먼저 검증하고 이를 iPSC에서 유래된 IPC 클러스터의 생존률 및 기능 평가에 적용한다. 연구 결과에 따르면 iPS에서 유래된 IPC 클러스터가 CRF 방법을 사용하여 동결되고 이후 해동될 때 3일 이상의 장기 보존 후에도 80% 이상의 생존률을 유지하는 것으로 나타났다. 또한 분화 후 IPC 분화 마커인 c-펩타이드가 17% 이상으로 확인되어 해동 후에도 클러스터의 분화능이 유지됨을 확인하였다. 추가적으로 췌장 전구체 단계에서 2D 분화에서 3D로 클러스터를 형성하며 분화하면 분화 후 기능이 향상되었다는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 iPS에서 유래된 IPC 클러스터를 CRF를 이용한 완만동결방법으로 동결할 수 있으며, IPC 클러스터의 임상 가능성을 높일 수 있을 것으로 기대한다.