17(18)-Epoxyeicosatetraenoic acid attenuates profibrotic signaling in idiopathic pulmonary fibrosis

Abstract

서론 특발성 폐섬유증(IPF)은 간질성 폐질환 중 한 종류로 예후가 매우 불량하고, 주로 고령의 남성에게 많이 발생한다고 알려져 있다. 또한, 최근 대사체가 IPF의 병태생리에 많은 영향을 주는 것으로 제시된 바 있다. 하지만 아직 IPF 병인과 관련된 대사체는 잘 알려져 있지 않은데, 이에 본 연구에서는 IPF와 연관된 대사체 후보물질을 발굴하여 IPF병태생리에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

방법 본 연구에서는 IPF 환자와 대조군의 폐 조직 및 혈액샘플을 이용하여 eicosanoid 대사체 분석을 진행하였고, 해당 대사체 분석으로 발굴된 마커 중 하나인 17(18)-EpETE 의 섬유화에서의 역할을 평가하였다. 인체 폐조직과 혈액에서 확인된 결과를 실험모델에서 검증하고자, 폐섬유증 세포 모형으로 TGF- β1을 MRC-5 cell 과 IPF 환자 조직검사로부터 얻은 조직에서 분리된primary human lung fibroblast 세포와 Epithelial세포 각각에 5 ng/ml 처리 후, 17(18)-EpETE는 6 μM씩 처리하여 폐섬유증 관련 signaling 경로와 연관 marker 발현을 확인하였다. 또한, 섬유화 marker 발현 확인을 위하여 면역형광법을 시행하였으며 각 그룹에서의 세포 발현 및 차이를 보기 위하여 유세포분석도 시행하였다. 동물모델에서의 17(18)-EpETE의 항 섬유화 효과 확인을 위하여 bleomycin으로 유도되어진 마우스 폐섬유화 모델에 17(18)-EpETE 100ng 을 매일 2주간 복강주사로 투입하였다.

결과 본 연구에서 시행된 IPF 환자와 대조군의 폐 조직 및 혈액샘플에서의 대사체를 분석한 결과, 17(18)-EpETE 은 두 그룹 간 유의성 있는 차이를 보였다. 두 세포에 같은 농도의 TGF- β1 와 17(18)-EpETE를 처리한 결과, 17(18)-EpETE 를 처리한 군에서 TGF- β1 단독 군에 비하여 Fibronectin 과 Collagen type-1 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다. Epithelial cell 인 BEAS-2B cell 에서도 같은 방법으로 실험한 결과 fibronectin 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 면역형광법을 통하여 fibroblast의 발현을 확인한 결과, TGF- β1 단독 군에 비하여 17(18)-EpETE 를 함께 투여한 군에서 fibronectin 의 발현이 감소되어 있음을 확인할 수 있었고, 유세포 분석에서는 fibroblast marker 인 vimentin 을 사용하여, TGF- β1 을 단독 투여한 그룹과 17(18)-EpETE 를 함께 투여한 그룹을 비교해본 결과, TGF- β1 그룹에 비해 17(18)-EpETE 를 투여한 그룹에서 발현이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. TGF- β1으로 폐섬유증을 유도시킨 세포에서 TGF- β1 signaling 경로 확인을 위하여 Smad 신호경로를 확인하였다. TGF- β1 자극시 Smad gene 은 인산화가 되어 inflammation을 유도시킨다고 알려져있다. TGF- β1 로 Smad 인산화를 유도시킨 후 17(18)-EpETE 6μM를 투여한 결과 인산화된 Smad-2 경로가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 섬유화가 유도된 mouse 군에 17(18)-EpETE 약물을 주입한 결과 100 ng 주입 시 mouse 폐 조직 내의 collagen 양 감소가 확인되었으며 H&E 염색에서도 100ng의 약물이 주입된 군에서 섬유화가 줄어든 것을 확인할 수 있었다.

결론 본 실험들을 통하여 IPF 환자군에서 발현이 감소되어 있는 17(18)-EpETE을 폐섬유화가 유도된 In vitro 모델과 In vivo 모델에 처리한 결과 항섬유화 효과를 보여줄 수 있음을 보여주었다. 아직까지 해당 대사체의 명확한 대사경로와 폐섬유증에 미치는 영향 연구가 많이 이루어 지지 않은 상황이지만 본 연구 결과를 기반으로 해당 물질의 대사 경로 연구와 in vivo 에서의 항섬유화 효과를 추가로 연구하여 IPF 질환의 치료 및 진단 바이오마커 타겟으로 활용할 수 있을 것으로 예측된다.|Background: 17(18)-Epoxyeicosatetraenoic acid (EpETE) is a lipid metabolite of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acids such as eicosapentaenoic acid (EPA). 17(18)-EpETE is known to have anti-inflammatory effects in inflammatory diseases. However, the role of 17(18)-EpETE in idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) remains unexplored. Methods: EETs were analyzed in human lung tissue (IPF =29, controls =15) using an Agilent 7890/5975 GC/MSD system and HP-5 MS column. The role of 17(18)-EpETE was evaluated using fibrotic markers in fibroblasts or epithelial cells treated with transforming growth factor-β1 (TGF-β1). Protein levels in cell lysates or tissues were measured by Western blot and immunofluorescence assays. Collagen levels in mouse lungs were measured by hydroxyproline assay and hematoxylin and eosin staining. Results: The levels of 17(18)-EpETE in IPF lung tissue were significantly reduced compared to control lung tissue. 17(18)-EpETE reduced TGF-β1-induced protein expression of collagen type 1 and fibronectin in MRC-5 cells and human lung fibroblasts. 17(18)-EpETE also reduced fibronectin levels in an immunofluorescence assay of human lung fibroblast cells treated with TGF- β1. In addition, 17(18)-EpETE reduced TGF- β1-induced protein expression of the epithelial mesenchymal transition (EMT) marker, fibronectin, in Beas-2B cells. 17(18)-EpETE reduced hydroxyproline levels in the lungs of bleomycin-induced mice. Conclusion: Our study suggests that 17(18)-EpETE may have anti-fibrotic effects on pulmonary fibrosis by suppressing fibroblast activation and epithelial cell EMT.