다발골수종세포에서 에리불린에 의한 세포 증식 억제 기전 연구

Abstract

배경: 다발골수종은 혈액암의 한 종류로 백혈구 중 B 림프구의 최종 성숙단계인 형질세포가 악성으로 전환되어 골수에서 비정상적으로 분화 및 증식하는 질환이다. 감염에 대항하여 신체를 보호할 수 있는 항체를 생산하는 정상적인 형질세포와 달리 다발골수종은 단클론단백이라고 하는 M 단백을 생성하게 되고 혈액이나 소변에서 발견되는 것이 특징이다. 다발골수종을 치료하기 위해 화학항암요법과 면역치료법 등이 사용되고 있지만 다양한 부작용과 높은 재발율과 같은 이유로 여전히 완치가 어려운 질환이다. 에리불린은 halichondrin B 에서 얻어진 합성 케톤 유사체로 전이성 유방암이나 지방육종에 사용되고 있는 항암제이다. 그러나, 다발골수종에서 에리불린에 효과에 대해서는 아직 연구된 바가 없다. Signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3)는 대부분의 암에서 종양 발생 및 진행에 기여하는 종양유전자로 다발골수종에서는 세포사멸을 억제하거나 골수유래억제세포를 활성화함으로써 다발골수종 진행에 관여한다. 따라서, 본 연구에서는 에리불린이 다발골수종 세포에서 STAT3 신호 전달 경로를 표적으로 하여 항종양효과가 있는지 확인하며 다발골수종의 치료제로써 어떤 효능을 보이는지에 대한 연구를 수행하였다. 방법: 다발골수종 세포주인 RPMI-8226, U266B1 에 에리불린을 72 시간 동안 처리한 후, MTS assay 와 BrdU assay 를 통해 세포 생존율과 세포 증식률을 확인하였다. Annexin V 염색을 통해 세포사를 확인하였고 caspase 활성도, Dioc6(3) 염색과 이와 관련된 단백질 발현을 통해 세포 사멸 경로를 분석하였다. STAT3 신호 전달 경로와 그 하위 단백질 발현과 STAT3-siRNA 형질주입을 통해 이와 관련된 단백질의 발현을 Western blot 을 통해 분석하였다. 결과: 다발골수종 세포주인 RPMI-8226 와 U266B1 에서 에리불린을 농도별로 72 시간 동안 처리한 후, 세포 생존율과 세포 증식률이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. RPMI-8226 세포에서 세포사 확인을 위해 Annexin V 양성 세포 비율을 유세포 분석을 통해 알아본 결과, 에리불린의 농도가 높아질수록 세포사가 발생하는 것을 확인하였다. Caspase 활성도와 관련 단백질인 Cleaved caspase -3, -7, -9 및 PARP-1 발현은 에리불린 농도가 높아짐에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 또한, Dioc6(3) 결과가 농도의존적으로 감소함에 따라 미토콘드리아 막 전위가 감소하는 것을 확인하였고 세포질 방향으로 Cytochrome C 의 방출량이 증가하는 것을 확인하였다. 미토콘드리아 경로와 관련된 단백질인 Bcl-2 의 발현은 감소하고, Bax 와 Bak 의 발현은 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 에리불린을 처리했을 때, p-STAT3 와 STAT3 의 발현이 감소했으며 이들의 하위 단백질인 Bcl-xL, Mcl-1, c-Myc, Cyclin D1, Cyclin D3 의 발현 또한 감소하는 것을 확인하였다. 결론: 에리불린은 다발골수종 세포주인 RPMI-8226 세포에서 STAT3 신호 기전이 관여하여 세포증식을 억제하고 caspase 의 활성과 미토콘드리아의 막 전위 감소를 통해 세포사멸을 유도한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 에리불린이 다발골수종의 새로운 치료 약물로 사용될 수 있는 가능성을 제시하였다.|Background: Multiple myeloma is a type of blood cancer in which plasma cells, the final maturity stage of B lymphocytes among white blood cells, are converted to malignant, causing abnormal differentiation and proliferation in the bone marrow. Unlike normal plasma cells that produce antibodies that can protect the body against infection, multiple myeloma produces an M protein called a monoclonal protein and this M protein is found in blood or urine. Chemotherapy and immunotherapy are used to treat multiple myeloma, but it is still difficult to cure for various side effects and high recurrence rates. Eribulin is a synthetic macrocyclic ketone analog obtained from halichondrin B and is an anticancer drug used for metastatic breast cancer or adiposarcoma. However, no research has yet been conducted on the effect of eribulin in multiple myeloma. STAT3 is an oncogene that contributes to the development and progression of tumors in most cancers, and in multiple myeloma, it is involved in the progression of multiple myeloma by inhibiting apoptosis or activating bone marrow-derived inhibitory cells. Therefore, in this study, we investigated whether eribulin has anti-tumor effects by targeting the STAT3 signaling pathway in multiple myeloma cells and can serve as a therapeutic agent for multiple myeloma. Method: Eribulin was treated with RPMI-8226 cells and U266B1 cells, a multiple myeloma cell line, cell survival and proliferation rates were confirmed through MTS assay and BrdU assay. Apoptosis was confirmed through Annexin V staining, and the path of apoptosis was analyzed through caspase activity, Dioc6(3) staining, and related proteins expression. The expression of proteins related to STAT3 signaling pathway and its downstream and expression of related proteins through STAT3-siRNA transfection were confirmed through Western blot analysis. Results: After Eribulin was treated with RPMI-8226 cells and U266B1 cells for 72 hours at each concentration, it was confirmed that cell survival and cell proliferation rates decreased in a concentration-dependent manner. As a result of confirming the proportion Annexin V-positive cells using flow cytometry, it was confirmed that apoptosis occurs as the concentration of eribulin increased. It was confirmed that caspase activity and the associated proteins cleaved caspase -3, -7, -9, and PARP-1 expression increased as the concentration of eribulin increased. In addition, it confirmed that as the Dioc6(3) results decrease, the mitochondrial membrane potential was decreased in concentration-dependent and that the release of Cytochrome C was increased. When the expression of proteins related to the mitochondrial pathway was confirmed, the expression of Bcl-2 decreased, and the expression of Bax and Bak increased. In addition, the expression of p-STAT3 and STAT3 was reduced, and the expression of downstream proteins Bcl-xL, Mcl-1, c-Myc, Cyclin D1, and Cyclin D3 was also reduced. Conclusion: In conclusion, its finding showed that eribulin inhibits cell proliferation and induces apoptosis through the activation of caspase and reduction of mitochondrial membrane potential by involving in STAT3 signaling mechanisms in RPMI-8226 cells. These results suggested that eribulin may be used as a new therapeutic drug for multiple myeloma.