Pde6b knockout 쥐에서 유리체강 내 및 망막하 주사를 통한 AAV 2, 5, 8형의 망막 형질 전달 비교 평가

Abstract

Introduction : To assess the transduction efficiency of AAV serotypes 2, 5, and 8 in the outer retina of Pde6b knockout rats and Sprague-Dawley rats, via route of intravitreal and subretinal injection techniques. Method : GFP-tagged AAV serotypes 2, 5, and 8 were administered via intravitreal or subretinal injection in Pde6b knockout rats at 3 weeks of age. Weekly in vivo fluorescence retinal imaging was conducted to monitor gene transfection distribution and assess the safety profile. After 6 weeks post-injection, the rats were euthanized, and the efficiency of retinal transduction was evaluated by analyzing fluorescence intensity of confocal microscope images following immunostaining. Additionally, the same methodology was applied to 7-week-old Sprague-Dawley rats, and they were monitored at 4, 8, 12, and 16 weeks for comparative analysis. Result : In Pde6b knockout rats that underwent subretinal injection, all three AAV serotypes successfully transduced photoreceptors and RPE cells in a similar pattern. In contrast, upon intravitreal injection, both AAV5 and AAV8 demonstrated a lack of transduction in both the inner and outer retina. Only AAV2 exhibited retinal tropism, although its effectiveness in the outer retina was limited. In Pde6b knockout rats, quantitative fluorescence analysis revealed that AAV5 exhibited a stronger fluorescence intensity in vivo and higher transduction in immunostaining compared to AAV2 and AAV8 after subretinal injection. Similarly, while only AAV2 successfully transduced the inner retina after intravitreal injection, all three AAV serotypes transfected the outer retina following subretinal injection in unaffected rats. Furthermore, except for procedure-related media opacity, no adverse side effects were observed. Conclusion : The subretinal injection of GFP-tagged AAV5 demonstrated higher transduction and retinal tropism than AAV2 and 8 in Pde6b knockout rats, suggesting its potential utilization in future clinical trials. |목적: Pde6b 녹아웃 쥐와 Sprague-Dawley 쥐의 외망막에서 AAV 2, 5, 8형의 전달 효율을 비교 및 평가하고자 하였다. 방법: GFP 표지 AAV 2, 5, 8형을 생후 3주 된 Pde6b 녹아웃 에 유리체강 내 및 망막하 주사로 투약하였다. 매주 생체 형광 망막 영상을 촬영하여 유전자 전달 분포를 모니터링하고 안전성을 평가하였다. 주사 6주 후에 쥐를 안락사시키고 형광 현미경 이미지의 형광 강도를 면역 염색 후 분석하여 망막 전달 효율을 평가하였다. 또한 동일한 방법을 7주 된 Sprague-Dawley 쥐에게 적용하고 4주, 8주, 12주, 16주에 비교 분석을 위해 면역 염색을 시행하였다. 결과: 망막하 주사를 시행한 Pde6b 녹아웃 쥐에서 세 가지 AAV 형 모두 유사한 패턴으로 광수용체와 망막색소상피세포에 성공적으로 전달되었다. 반면 유리체강내 주사를 시행한 군에서는 AAV5와 AAV8 모두 내망막과 외망막 모두에서 전달이 부족한 것으로 나타났다. AAV2만이 망막 친화성을 보였지만 외망막에서의 효과는 제한적이었다. Pde6b 녹아웃 쥐에서 정량적 형광 분석 결과, AAV5는 망막하 주사 후 AAV2와 AAV8에 비해 더 강한 형광 강도를 보였고 면역 염색에서 더 높은 전달 효율을 보였다. 마찬가지로 Sprague-Dawley 쥐에서는 유리체강 내 주사 후에는 AAV2만 내망막에 성공적으로 전달되었지만, 망막하 주사 후 세 가지 AAV 형 모두 외망막에 전달되었다. 또한 주사 관련 매체 혼탁을 제외하고는 AAV 관련 면역 부작용은 관찰되지 않았다. 결론: GFP 표지 AAV5의 망막하 주사는 Pde6b 녹아웃 쥐에서 AAV2와 8보다 높은 망막 전달 효율과 친화성을 보였으며, 향후 임상 시험에 활용될 가능성을 시사한다.