In-Depth Analysis of Amikacin Susceptibility in Mycobacterium avium Complex: Validation of Minimum Inhibitory Concentration in the Presence of Trailing Growth

Abstract

Background: Amikacin is tested as a first-line drug for Mycobacterium avium complex (MAC). MAC often shows trailing growth in amikacin well when broth microdilution minimum inhibitory concentration (MIC) is measured. Although Clinical and Laboratory Standards Institute recommends reading amikacin MIC at the concentration of complete inhibition, trailing growth often causes a subjective variation in MIC readings and a shift in MIC toward false resistance. Therefore, this study was performed to evaluate the effect of trailing growth of MAC on amikacin MIC and suggest the objective criteria to read MIC in trailing growth.

Methods: From November 2021 to April 2022, antimycobacterial susceptibility tests were performed request-based for clinical isolates of MAC using Sensititre SLOMYCOI (Thermo Fisher Scientific, Cleveland, OH, USA). For strains with an amikacin MIC of 32 μg/mL or higher, the AST was re-tested, and the MIC was determined at the point of trailing growth onset. The onset of trailing growth is defined as the point where a notable decrease in bacterial growth is observed compared to the preceding well, and where increasing concentrations of amikacin do not result in any additional inhibition of bacterial growth. Mutations in the rrs gene were additionally tested for all isolates included in the study. Amikacin treatment history was searched for patients corresponding to all isolates included in the study. MIC corresponding to the 50th percentile (MIC50) and 90th percentile (MIC90) of MAC isolates were determined and the epidemiological cut-off (ECOFF) value was also calculated using the ECOFFinder algorithm. The MIC50, MIC90 and ECOFF values of the study isolates were validated by comparison with the amikacin MIC distribution in the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) deposited data set. This study was approved by the Institutional Review Board of Asan Medical Center (S2022-1595-0001).

Results: A total of 134 isolates including 67 M. intracellulare, 65 M. avium, and 2 M. chimaera were tested for AST and interpretation of amikacin MIC resulted in 44 (32.8%) being categorized as intermediate and 29 (21.6%) as resistant. A total of 72 isolates (53.7%) of M. intracellulare and M. avium, classified as intermediate and resistant, were re-tested using the SLOMYCOI panel, with MIC reading at the concentration which trailing growth started. Among them, 44 isolates of MAC were changed to more susceptible category when trailing growth was considered no growth; 10 and 4 isolates of M. intracellulare changed from resistant to intermediate or susceptible, respectively, and 1 and 4 isolates of M. avium changed from resistant to intermediate or susceptible, respectively. Any of MAC isolates including one of resistant category did not carry rrs mutation. The MIC50, MIC90, and ECOFF values of the study isolates were in excellent agreement with the distribution of amikacin MICs from EUCAST. Among all patients included in this study, six had a history of amikacin treatment. Of those, only one had a history of six month treatment with amikacin and MAC isolate from the patient exhibited definite resistant MIC of greater than 64 against amikacin.

Conclusion: At initial readout, amikacin resistance amounted to 21.6% of clinical isolates, however the resistance was not correlated with rrs mutations in our study. When CLSI interpretation conditions were strictly followed, amikacin resistance rates were much higher than clinical expectations due to trailing growth. To make the current CLSI breakpoints clinically meaningful, we believe it is best to read the MIC at the concentration trailing growth started.|배경: 아미카신은 Mycobacterium avium complex(MAC)에 대한 항균제 감수성 검사를 시행할 때 평가해야하는 1차 약제이다. MAC은 액체배지 미량희석법 (broth microdilution)으로 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정할 때 아미카신 well에서 후행성장(trailing growth)을 종종 보인다. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 가이드라인에서는 균의 성장이 완전히 억제되는 농도에서 아미카신의 MIC를 읽을 것을 권장하지만, 후행성장은 종종 MIC 판독에서 주관적인 차이를 발생시키게 되고, 위내성 쪽으로 MIC를 높이는 원인이 된다. 따라서, 이 연구는 MAC의 후행성장이 아미카신 MIC에 미치는 영향을 평가하고, 후행성장에서 MIC를 객관적으로 판독하는 기준을 제시하기 위해 수행되었다.

대상 및 방법: 2021년 11월부터 2022년 4월까지 MAC의 임상 분리 균주에 대한 항균제감수성시험(antimycobacterial susceptibility test, AST)는 Sensititre SLOMYCOI (Thermo Fisher Scientific, Cleveland, OH, USA)를 사용하여 요청 기반으로 수행되었다. 아미카신 MIC가 32 μg/mL 이상인 균주에 대해서는 AST를 재검사하였고, MIC는 끌림성장의 시작 지점에서 결정되었다. 끌림성장의 시작은 이전 well과 비교하여 박테리아 성장이 눈에 띄게 감소하고 아미카신 농도를 증가시켜도 추가적인 균 성장 억제가 관찰되지 않는 지점으로 정의하였다. 모든 연구대상 균주에 대한 rrs 유전자 변이가 추가적으로 검사되었으며, 모든 연구 대상 환자들의 아미카신 치료력 또한 조사되었다. 연구에 포함된 MAC 균주의 50번째 백분위수(MIC50)와 90번째 백분위수(MIC90)의 최소억제농도가 결정되었고, 역학적 판정 기준치(epidemiological cut-off value, ECOFF)도 ECOFFinder 알고리즘을 사용하여 계산되었다. 연구에 포함된 균주의 MIC50, MIC90 및 ECOFF 값은 유럽 항균제 감수성 검사 위원회 (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST)에 제출된 데이터세트의 아미카신 MIC 분포와 비교하여 검증되었다. 이 연구는 아산병원 기관 윤리위원회의 승인을 받았다(S2022-1595-0001).

결과: 총 134주의 임상 분리 균주(M. intracellulare 67주, M. avium 65주 및 M. chimaera 2주)에 대한 AST가 시행되었으며, 아미카신 MIC 판독이 중간인 범주는 44주(32.8%), 내성인 범주는 29주(21.6%)로 분류되었다. 감수성이 중간 및 내성으로 분류된 총 72주(53.7%)의 M. intracellulare 및 M. avium 균주들을 SLOMYCOI를 사용하여 재검사하였고, 후행성장의 시작지점을 MIC로 판독하였을 때, MAC 44주는 더 감수성인 범주로 변경되었다. 아미카신 내성이었던 M. intracellulare 균주 중 10주는 중간, 4주는 감수성으로 변경되었으며, 내성이었던 M. avium 균주 중 1주는 중간, 4주는 감수성으로 변경되었다. 처음 내성 범주였던 MAC 중 rrs 유전자 변이를 가진 균주는 발견되지 않았다. 균성장에서 후행성장을 제외하고 MIC를 판독하는 경우 MIC50, MIC90 및 ECOFF값은 EUCAST 감수성 누적 데이터 상의 아미카신 MIC 분포와 잘 일치하였다. 6명의 환자만 아미카신 치료력이 있었고, 단 한 명만 아미카신으로 6개월 동안 장기 치료를 받았으며, 치료기간 중 분리된 MAC 균주는 아미카신 MIC가 64 g/mL 이상으로 나타나 확실한 내성으로 판독하였다.

결론: CLSI 가이드라인의 판독 조건에 따르면 아미카신에 대한 내성 비율이 21.6%에 달하였지만 rrs 유전자 변이가 동반된 경우가 없고, 아미카신 사용력은 1명에서만 관찰되어 위내성이 의심되었다. 초기 판독에서 아미카신 감수성이 아닌 균주들에서 후행성장이 관찰되었으며, 후행성장을 균자람에서 제외할 때 아미카신 내성률이 임상적으로 납득할만한 수준으로 낮아졌다. 결과적으로 후행성장이 있는 균주들의 MIC는 후행성장이 시작되는 지점을 읽는 것이 CLSI 감수성 판정기준을 적용했을 때 위내성을 방지할 수 있을 것으로 판단되었다.