Studies on efficient prokaryotic production of several cytokines and growth factors

Abstract

Studies on efficient prokaryotic production of several cytokines and growth factors Nguyen Thi Kieu Oanh The Graduate School of the University of Ulsan College of Medicine Recombinant proteins have comprehensive applications in different fields, including therapeutics, vaccines, industrial productions, agriculture, gene therapies, and research developments. Escherichia coli (E. coli) is a common expression system for producing recombinant human proteins. Nevertheless, protein misfolding and aggregation into inclusion bodies often need additional steps in protein purification. This study explores five proteins that tend to misfold and form inclusion bodies in E. coli: human granulocyte-macrophage colony- stimulating factor (GM-CSF), interleukin-3 (IL3), interleukin-6 (IL6), keratinocyte growth factor (KGF), and insulin-like growth factor 1 (IGF1). To conquer these challenges, fusion tags such as maltose binding protein (MBP) or the b' a' domain of protein disulfide isomerase (PDIb'a') were set up at the N-terminus of the fusion proteins. This strategy remarkably improved expression levels and solubility when expressed in E. coli strains. The protein constructs exhibited high soluble expression levels, qualifying recombinant protein isolation. Purified proteins were further identified and verified through biological activity assays. Comprising PDIb'a' tags and using genetically modified ClearColi E. coli strains, coupled with moderate temperature culture conditions (30°C), proved instrumental in successful protein production, and facilitated straightforward purification procedures. The purification process involved three main steps: primary purification using affinity chromatography, cleavage of the fusion protein with TEV protease, and subsequent ion exchange chromatography to obtain purified proteins. Intriguingly, the fusion proteins exhibited higher bioactivity in in vitro assays than their non-fused counterparts. This study represents the first successful attempt to express and purify soluble human recombinant proteins GM-CSF, IL3, IL6, KGF, and IGF1 in the ClearColi E. coli strain using innovative PDIb'a' tags. These findings offer the potential to enhance biopharmaceutical manufacturing by implementing efficient processes, potentially improving scalability and cost-effectiveness. The approach presented here opens new avenues to produce challenging recombinant proteins and may have significant implications for developing novel therapeutics and research applications.

Keywords: Escherichia coli (E. coli), prokaryotic soluble expression, keratinocyte growth factor (KGF), insulin-like growth factor 1 (IGF1), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interleukin-3 (IL3), and interleukin-6 (IL6), fusion tags, the b'a' domain of protein disulfide isomerase (PDIb'a').|재조합 단백질은 치료제, 백신, 산업 생산, 농업, 유전자 치료, 연구 및 개발 등 다양한 분야에서 광범위하게 적용되어 왔다. 대장균(Escherichia coli)은 재조합 인간 단백질을 생산하는 데 일반적으로 사용되는 발현 시스템이다. 그러나 단백질 잘못 접힘과 봉입체 형성은 종종 어려움을 야기하며, 후속 정제 단계를 복잡하게 만들었다. 이 연구는 대장균에서 잘못 접히고 봉입체를 형성하는 경향이 있는 것으로 알려진 다섯 가지 단백질인 인간 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 인터루킨-3(IL3), 인터루킨-6(IL6), 각질세포 성장 인자(KGF), 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1)을 조사했다. 이러한 어려움을 해결하기 위해 맥아당 결합 단백질(MBP)이나 단백질 이황화물 이성질체(PDIb'a')의 b' a' 도메인과 같은 가용화 태그를 융합 단백질의 N-말단에 도입했다. 이 접근법은 다양한 대장균 균주에서 발현될 때 발현 수준을 크게 높이고 용해도를 개선했다. 단백질 구성체는 높은 수준의 가용성 발현을 산출하여 재조합 단백질의 분리를 가능하게 했다. 정제된 단백질은 이후 생물학적 활성 분석을 통해 확인되고 검증되었다. PDIb'a' 태그의 도입과 유전적으로 변형된 ClearColi 대장균 균주의 사용은 온화한 온도(30°C) 배양 조건과 결합되어 성공적인 단백질 생산에 중요한 역할을 하였으며 간단한 정제 절차를 가능하게 했다. 정제 과정은 친화성 크로마토그래피를 사용한 1차 정제, TEV 프로테아제를 사용한 융합 단백질 절단, 이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제된 단백질 획득의 세 가지 주요 단계를 포함했다. 흥미롭게도, 융합 단백질은 비융합 대응물에 비해 시험관 내 분석에서 더 높은 생물 활성을 나타냈다. 이 연구는 혁신적인 PDIb'a' 태그를 사용하여 ClearColi 대장균 균주에서 가용성 인간 재조합 단백질 GM-CSF, IL3, IL6, KGF 및 IGF1을 발현하고 정제하는 최초의 성공적인 시도였다. 이러한 발견은 효율적인 공정을 구현함으로써 생물 의약품 제조를 향상시킬 가능성을 제공하며, 잠재적으로 확장성과 비용 효율성을 개선할 수 있다. 여기에 제시된 접근법은 난제 재조합 단백질 생산을 위한 새로운 길을 열어주며, 새로운 치료제 개발과 연구 응용에 상당한 영향을 미칠 수 있다.

중심단어: 대장균(E. coli), 원핵생물 가용성 발현, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 인터류킨-3 (IL3), 인터류킨-6 (IL6), 각질세포 성장 인자 (KGF), 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF1), 융합 태그, 단백질 이황화 이성질화효소 (PDIb'a')의 b'a' 도메인.