CD34+ HSCs기반 인간화 마우스에서 구축한 췌장암 동소이식모델의 종양학적 특성 및 anti-PD-1 antibody 처치에 따른 종양면역학적 변화 분석

Abstract

PART I 췌장암에서 면역항암제의 효능을 평가하기 위해서는 인간 면역시스템을 잘 반영할 수 있는 전임상 동물 모델이 필요하다. 췌장암 환자 대부분이 유전자 돌연변이를 가지고 있기 때문에 다양한 종양학적 특징을 가지는 것 또한 면역항암제의 효능을 확인하는데 중요한 요소로 작용될 수 있다. 본 연구에서는 췌장암 인간화 마우스를 제작하여 췌장암 환자들이 가지는 다양한 종양학적 특징을 반영할 수 있는지 확인하였다. 췌장암 동소이식 모델을 제작하기 위해서 KRAS wild type 세포주인 BxPC3_luc와 KRAS G12D type인 AsPC1_luc 세포주를 CD34+ hematopoietic stem cell (HSCs) 기반 인간화 마우스의 췌장에 이식하였다. 이식 후 종양 크기 및 위치를 확인하기 위해서 이식한 췌장암 세포주 모두 luciferase가 transfection된 세포주를 실험에 사용하였다. In Vivo Imaging System (IVIS)과 Positron emission tomography-Magnetic resonance (PET-MR)를 이용하여 종양의 생성과 위치를 확인할 수 있었다. 그리고 flow cytometry를 사용하여 혈액과 종양 내 침윤된 인간면역세포들의 분포를 확인하였을 때, hCD45(+) cells이 AsPC1_luc group의 혈액에 많이 존재할 뿐 아니라 종양조직 내에 침윤된 비율도 더 높은 것을 확인하였다. AsPC1_luc group의 종양조직 내에 침윤된 인간면역세포 중에서도 hCD3(+) 세포와 hCD11b(+) 세포가 BxPC3_luc group과 비교했을 때 유의미하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 종양조직 내에 침윤된 면역세포가 AsPC1_luc group에 많은 것과 Extracellular matrix (ECM) composition의 연관성을 확인하기 위해서 MT(Masson’s Trichrome) staining을 진행하여 ECM intensity 분석을 진행하였다. 그 결과 전체 ECM 부분이 AsPC1_luc group에서 유의미하게 낮은 것을 확인할 수 있었고, 그 중에서도 ECM_dense 부분이 BxPC3_luc group에 비해 유의미하게 낮은 것을 확인할 수 있었다. 이를 근거로, 면역세포가 종양조직 내에 침윤될 때 ECM intensity의 영향을 받는 것을 확인할 수 있었다. 인간화 마우스에서 유래한 종양조직으로 세포주와 오가노이드를 구축하여 각각이 가지는 특징을 flow cytometry를 통해 확인해봤을 때, 종양 특이적 마커들에서 parental cell line과 유사한 발현을 가지는 것을 확인하였고, 계대가 진행됨에 따라 그 특성이 계속 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 특히나 인간화 마우스의 종양조직에서 구축한 세포주와 오가노이드의 경우 Programmed death-ligand 1 (PD-L1)의 발현 값이 parental cell line에 비해 줄어든 것을 확인하였다.

Keywords: Pancreatic cancer, Humanized mouse, Orthotopic model, KRAS mutation, Organoid|PART II 앞서 동소이식 인간화 마우스가 췌장암 환자들이 가지는 종양미세환경의 특징을 반영할 수 있다는 것을 확인하였고, 이 모델이 면역항암제 후보약물들의 효과를 평가하기 위한 전임상 모델로서 활용이 가능하다는 것을 검증하기 위해서 추가 실험을 진행하였다. CD34+HSCs 기반 인간화 마우스에서 구축한 BxPC3_luc 모델의 종양 조직과 인간 췌장암조직의 유사성을 확인하기 위해서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 진행하였다. 각 조직에 침윤된 세포에서 mRNA 발현 수준에 대한 분석을 진행하였고, 동일한 마커들을 발현하는 세포들의 클러스터들을 확인했을 때, 인간 종양조직과 인간화 마우스 종양조직의 단일세포 분포의 특징이 유사함을 확인할 수 있었다. 인간의 종양미세환경을 잘 반영하는 인간화마우스에서 면역항암제의 효능을 평가하기 위해 anti-PD-1 항체를 주 5회 복강으로 주입하였다. IVIS 촬영을 통해 주 1회 종양의 성장을 비교하였고, 이후 종양 무게를 측정했을 때 anti-PD-1 항체 투여 그룹에서 종양의 성장과 무게가 control 그룹보다 다소 낮은 것을 확인할 순 있었지만 유의미한 차이는 확인할 수 없었다. 추가적으로 인간화마우스의 혈액과 종양조직에서 인간 면역세포의 분포를 확인하기 위해서 유세포분석을 진행하였다. 그 결과 anti-PD-1 항체 투여군에서 hCD45(+) CD11b(+) Myeloid 세포가 증가하였고, hCD45(+) CD3(+) T 세포는 감소하였다. 그리고 혈액과 종양조직에서 hCD3(+)CD8(+) T 세포의 PD-1 발현이 감소한 것을 확인하였고, anti-PD-1 antibody 투여군에서 hCD3(+)FoxP3(+) T 세포의 비율과 활성화가 control 그룹에 비해 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 분석을 통해, 인간화마우스 기반의 췌장암 종양 모델이 면역 항암제 후보물질들의 유효성 평가와 세밀한 면역 분석을 진행하기에 적절한 모델임을 확인하였다.

Keywords: Pancreatic cancer, Humanized mouse, Orthotopic model, Immunotherapy