mTOR 발현 저해를 통한 당뇨망막병증 치료 가능성 연구

Abstract

Purpose: The standard of care for diabetic retinopathy (DR) has heretofore consisted of laser photocoagulation and anti-VEGF therapeutics. However, drawbacks exist for both forms of treatment, with the short durations of activity for the latter being of particular import as they necessitate frequent administration via intravitreal injections. The treatments are additionally narrowly focused in scope and may be limited in their abilities in comprehensively addressing the multifactorial nature of DR. Due to the complex pathophysiology of DR, a therapeutic target with broad efficacy, specifically the mechanistic target of rapamycin (mTOR), may prove to be beneficial in helping to address these concerns. Furthermore, the utilization of gene therapy as a treatment strategy would provide long-lasting effect in a patient-friendly manner, thereby overcome the most significant limitation of currently-used therapeutics. Methods: A single high-dose of streptozotocin (STZ) was administered to 7-week old male C57/BL6 mice via intraperitoneal injection to generate a diabetic animal model, with intravitreal injection of the control and therapeutic virus vectors, the latter consisting of a mTOR-inhibiting shRNA packaged in a recombinant adeno-associated virus (rAAV2-shmTOR-SD), occurring one month later. Assays performed on mouse retinas isolated post-sacrifice two months thereafter include trypsin digest preparations to examine the retinal vasculature, FITC-dextran straining, TUNEL assay, and immunohistochemistry to determine virus vector tropism. Additionally, H&E staining was performed on retinal samples taken from mice sacrificed six months after STZ administration to visualize the cell layers of the retina. Results: Previously, it was demonstrated in a rat model of oxygen-induced retinopathy that the therapeutic virus vector is able to address the vascular aspect of DR via its anti-angiogenic activity, whereas rAAV2-shmTOR-SD was shown here to exert a therapeutic effect upon early DR processes. Intravitreally injected rAAV2-shmTOR-SD effectively transduced the mouse retinas and markedly downregulated mTOR expression, as compared to sham-treated and control virus vector-injected (rAAV2-shCon-SD) control groups. This lead to significant reductions in pericyte loss, a consequential early histopathological characteristic of DR, while also reducing acellular capillary formation, vascular permeability, and the thinning of retinal cell layers, with all of these processes being key contributors to DR progression. rAAV2-shmTOR-SD also reduced the pathogenic activation and proliferation of Müller cells while being anti-apoptotic and decreasing retinal ganglion cell loss, with this data combining to suggesting that the therapeutic virus vector possesses neuroprotective qualities as well. Conclusions: Taken together, these results continue to demonstrate the great promise of rAAV2-shmTOR-SD as a potential human gene therapeutic versus DR due to its broad ability to address various aspects of DR pathophysiology. |목적: 당뇨망막병증의 치료제로는 레이저 광촉매와 anti-VEGF 치료가 있다. 그러나 두가지 치료 형태 모두 단점이 존재하며, 특히 안구 내 주사를 통한 적용방법은 짧은 활성 때문에 빈번한 관리가 필요하다. 또한 이 두가지 치료법은 적용되는 병증이 매우 제한적으로, 이는 당뇨망막병증의 다원적 발병 특성을 포괄적으로 다루는 능력에 한계가 될 수 있다. 당뇨망막병증의 복잡한 병리생리학 때문에 광범위한 효능을 가진 치료 대상인 mTOR가 이러한 문제를 해결하는데 도움이 될 수 있다. 게다가 유전자 치료를 치료전략으로 활용하는 것은 환자 친화적인 방식으로 오래 지속되는 효과를 제공하여 현재 사용되는 치료법의 가장 중요한 한계를 극복해 줄 것이 기대된다.

방법: 당뇨병 동물 모델을 만들기 위해 7주령의 C57/BL6 생쥐 복강 내로 고농도의 스트렙토조토신(STZ)를 단 회 투여하였다. 그리고 대조군 및 rAAV2-shmTOR-SD 인 치료 바이러스 벡터를 안구 내로 주사하였다. 이 후 생쥐를 희생하여 망막을 분리하였고 망막 혈관 구조를 확인하기위한 trypsin digest, 바이러스 벡터 tropism을 확인하기 위한FITC-dextran 염색, TUNEL assay, IHC를 진행하였다. 게다가 STZ적용 후 6개월 뒤 H&E 염색을 통하여 망막의 세포 층들을 관찰하였다.

결과: 이전에 치료 바이러스 벡터는 항 혈관 신생 활성을 통해 당뇨망막병증의 혈관을 치료 할 수 있다는 것이 산소 유도에 의한 망막증 랫드 모델에서 밝혀졌었다. 반면에 rAAV2-shmTOR-SD는 DR의 초기 과정에 치료 효과를 나타냄을 이번 연구에서 확인하였다. 실제로 마우스에 주입된 rAAV2-shmTOR-SD는 sham 및 rAAV2-shCon-SD 처치 그룹에 비해 현저하게 mTOR 발현이 낮아지는 것을 확인하였다. 이는 DR의 초기 병리학적 특성인 혈관주변세포 손실을 크게 억제시키는 동시에 세포 모세관 형성, 혈관 투과성 및 망막 세포층의 얇아지는 것을 억제하였다. 또한 rAAV2-shmTOR-SD는 Müller 세포의 병원성 활성화 및 증식을 감소시켰으며, 세포 사멸과 망막신경절세포의 감소를 억제하였다. 이러한 결과는 치료 바이러스 벡터가 신경 보호 특징도 가지고있음을 확인하였다.

결론: 본 연구결과를 통해, 당뇨망막병증 치료에 대한 rAAV2-shmTOR-SD의 광범위한 능력을 병리생리학적 관점에서 다각도로 검증했으며, 이에 따라 rAAV2-shmTOR-SD가 갖는 당뇨망막병증 치료용 유전자 치료제로서의 미래 가능성을 성공적으로 제시할 수 있었다.