H9c2 세포에서 허혈-재관류 시뮬레이션 동안의 불안정 철 변화

Abstract

Recently, we developed a simulated ischemia-reperfusion (SIR) model using H9c2 cardiac myoblast cell line. Unlike traditional oxygen-glucose deprivation (OGD) models in which serum was also excluded during simulated ischemia (SI), we simulated ischemic condition by hypoxia combined with lactic acidosis and included dialyzed fetal bovine serum (diFBS). In this model, we confirmed simulated reperfusion (SR)-induced necrotic cell death, which had not been observed in former OGD models. On the other hand, it has been reported that ischemia/reperfusion (I/R)-induced injury was associated with labile iron-dependent Fenton reaction. However, whether labile iron pool (LIP) is changed during ischemia or reperfusion, is controversial. Therefore, we attempted to monitor the changes in LIP during SIR and investigate the association with SR-induced necrotic cell death using the newly developed SIR model. After SI for 24 hours, cells were incubated in a normal culture medium for 17 hours for SR. We measured lactate dehydrogenase (LDH) release to estimate the necrotic cell death during SIR. And found that LDH release was rapidly increased in the early phase of SR. Meanwhile, LIP was measured with the calcein-acetoxymethyl ester (AM) (a fluorescent iron chelator). In results, total LIP was significantly increased during SI. The increased LIP included a significant level of Fe3+, which was practically undetectable in normal cells. We observed that the Fe2+ was further oxidized to Fe3+ for 1 hour of SR. The total LIP level was not changed while the Fe2+ was lowered and Fe3+ was increased. These changes implied Fenton reaction which might be associated with lipid peroxidation. To observe lipid peroxidation, we used BODIPY C11 (a lipid peroxidation probe) during SR, and found that lipid peroxidation occurred in early phase of SR. In the next step, we investigated which iron sources contribute to the increase of LIP during SI. It is well known that most intracellular iron is present as ferritin (an iron storage protein) form or heme protein form. We investigated whether bafilomycin A1 (Baf A1, a V-ATPase inhibitor) could inhibit the increase of LIP, possibly via inhibition of autophagy-mediated ferritin degradation during SI. Baf A1 partially suppressed the increase of LIP during SI and decreased SR-induced damages. We also examined whether zinc protoporphyrin (ZnPP, a heme oxygenase-1 inhibitor) could inhibit the increase of LIP, possibly via inhibition of HO-1-mediated heme degradation during SI. ZnPP decreased elevation of LIP and decreased SR-induced damages. In summary, we developed the SIR model and investigated the changes in LIP during SIR. We found that the LIP was increased during SI, a significant portion of which was oxidized to Fe3+ in the early phase of SR. It was also shown that these changes in LIP were accompanied by lipid peroxidation and cell death.|H9c2 심근세포주를 이용하여 새로운 허혈-재관류 시뮬레이션 모델을 구축했다. 허혈 동안 영양분 결핍과 젖산 산증, 무산소증이 나타난다고 알려져 있다. 혈청을 사용하지 않는 전통적인 산소-글루코스 결핍 모델과는 다르게, 본 연구에서는 혈장 결핍에 따른 성장 인자와 호르몬의 결핍에 의한 효과를 방지하면서, 이 특징을 세포 배양 조건에 적용하는데 용이한 투석한 소 태아 혈청을 사용했다. 산소-글루코스 결핍 모델에서는 나타나지 않았던 재관류 시뮬레이션에 의한 괴사성 세포 사멸이 본 모델에서 나타나는 것을 확인했다. 허혈-재관류에 의한 손상은 불안정 철에 의존적인 Fenton 반응과 연관 있다는 것이 보고 되었다. 하지만 허혈 또는 재관류 동안 불안정 철이 변하는지에 대해서는 논란의 여지가 있다. 본 연구를 통해 허혈-재관류 시뮬레이션 동안 불안정 철을 관찰하고 재관류에 의한 괴사성 세포 사멸과의 연관성을 조사하였다. 허혈의 시뮬레이션을 위해 투석한 소 혈청 10% 와 함께 H9c2 세포를 저산소증과 젖산 산증에 노출시켰다. 허혈 시뮬레이션 이후, 재관류 시뮬레이션을 위해 다시 원래의 배양 배지에 노출시켰다. 괴사성 세포사멸을 확인하기 위해 Lactate dehydrogenase (LDH) 유출을 측정한 결과, LDH 유출은 허혈 시뮬레이션 동안이 아닌 재관류 시뮬레이션 초기에 급격히 증가하였다. 재관류 시뮬레이션에 의한 세포 손상과 불안정 철의 연관성을 조사하였다. 불안정 철은 Calcein-AM (형광 킬레이트제) 을 이용하여 측정하였다. 전체 불안정 철은 일반적인 상태의 세포에 거의 존재하지 않는 Fe3+를 포함하여 허혈 시뮬레이션 동안 증가하였고, 함께 증가한 Fe2+이 재관류 시뮬레이션 1시간 동안 Fe3+으로 산화되는 것을 확인하였다. 재관류 시뮬레이션 1시간 동안 전체 불안정 철은 변화하지 않으면서 Fe2+는 감소하였고 Fe3+는 증가하였다. 이 결과는 Fenton reaction이 발생했을 가능성을 시사하며 이 반응은 지질 과산화 반응을 일으킬 수 있다. 지질 과산화의 여부를 확인하기 위해 BODIPY C11을 사용하였다. 그 결과, 재관류 시뮬레이션 초기에 지질 과산화가 진행되는 것을 확인하였다. 어느 철의 출처가 허혈 시뮬레이션 동안의 불안정 철의 증가에 기여하는지 조사하였다. 세포 내의 대부분 철은 철의 저장 단백질인 ferritin 철과 heme 단백질과 연관된 철로 이루어져 있기에 Ferritin의 분해 기전에 관여하는 Bafilomycin A1 (Baf A1)과 Heme의 분해 효소인 Heme oxygenase-1 (HO-1)의 억제제를 허혈 시뮬레이션 동안 사용하였다. 그 결과, Baf A1, V-ATPase 억제제가 허혈 시뮬레이션 동안의 불안정 철의 증가와 재관류 시뮬레이션에 의한 손상을 억제하였다. 이는 Autophagy에 의한 Ferritin 분해가 LIP의 증가에 영향을 미쳤을 가능성을 나타낸다. 또한, Zinc protoporphyrin (HO-1 억제제)가 불안정 철의 상승을 억제하고 재관류 시뮬레이션에 의한 손상을 감소시켰으며 이는 Heme 분해에 의한 LIP가 증가했을 가능성을 시사한다. 본 연구를 통해 기존의 산소-글루코스 결핍 모델에서 발전시킨 허혈 시뮬레이션 모델을 이용하여 허혈-시뮬레이션 동안 증가한 불안정 철이 재관류-시뮬레이션 초기 동안 Fenton 반응과 함께 지질 과산화를 일으키는 것이 재관류에 의한 세포 손상 기전임을 알아내었다.