랫드 실험을 통한 절단 신경 말단에서 재생 말초 신경 인터페이스의 효용성 연구

Abstract

Introduction As the morbidity of extremities amputation increases, social costs of treatment and rehabilitation are rapidly increasing. The existing prosthesis has developed a lot so far, but it shows various limitations in actual use. The amputated patients not only from functional loss but also from painful neuroma for a long time ago. As a fundamental solution, various research on robot bionic limbs is actively underway. Natural electric signal control to spinal cord, peripheral nerve, and muscle is essential for bionic limbs to implement sophisticated human movements. Wearing type prosthesis is easier to use than implemented type, but it is difficult to implement a model that accepts electric signals from the nerve end on the skin surface. By several previous studies, we know that peripheral neural signals are biologically amplified at the extremities and converted into myographic signals, and expect intuitive control of the upper and lower extremities robot limbs if we can record and control them properly. For this purpose, the technology of implanting free muscle graft at the nerve end to make regenerative peripheral nerve interface (RPNI) to amplify electric signals has recently been in the spotlight. The main purpose of this study is to prove the scientific basis of RPNI through electrophysiological studies using rats. Furthermore, we would like to compare its effects with simple amputation models and provide experimental basis for the development of RPNI.

Methods A total of 24 Lewis rats (8 weeks of age) were divided into 4 groups. Group 1: Control group – only dissect the sciatic nerve and peroneal nerve Group 2: Common peroneal nerve (CPN) amputation group – amputate common peroneal nerve after dissection Group 3: RPNI 1 group – form one RPNI at the end of common peroneal nerve using part of the biceps femoris muscle Group 4: RPNI 2 group – form two RPNIs at the two division of common peroneal nerve end using part of the biceps femoris muscle 1. Creating a RPNI model in rats After performing an incision on a rat’s hind leg, opened the deep fascia and separated biceps femoris muscle and gluteus muscles. Dissection of the sciatic nerve was done till the bifurcation point of tibial nerve, common peroneal nerve, and sural nerve was exposed. At the end of the peroneal nerve, the surgery was performed as specified in each group. Group 1 recorded the electrophysiological studies results after only dissection was implemented. 2. Primary electrophysiological studies – Nerve conduction study (NCS) Immediately after the creating of RPNI, NCS and EMG was done to operation site by TECA Synergy (Viasys healthcare, UK). We catched the signal from anterior compartment of lower leg muscles or RPNI stimulating sciatic nerve. After examinations, simple interrupted sutures layer by layer were performed at operation site using Vicryl Rapide (polyglactin 910; Ethicon, Somerville, NJ, USA) 4-0. 3. Secondary electrophysiological studies – Electromyography (EMG) Postoperative two weeks, a non-invasive electrophysiological study was conducted–EMG. Resting Needle EMG was done and the needle lead was inserted into the anterior compartment of lower leg muscles of the rat and obtained the number of abnormal spontaneous activity (ASA) per 5 seconds. 4. Third electrophysiological studies – NCS, EMG Postoperative four weeks, opened the previous incision and conducted NCS again in the same manner. Resting needle EMG was conducted again. Both test results were recorded and compared with the results of the previous one. 5. Obtain the pathological specimen After conducting final electrophysiological studies, part of the RPNI specimen was extracted and sent to pathologist for further examination. The operation site was sutured in the same way as the first operation. 6. Statistical analysis For comparison between groups, the paried t-test method was used. A non-parametric test such as Kruskal-wallis test was used to compare the means between multiple groups.

Results 1. Comparison of the nerve conduction study results In the operation day, the average latency of each groups was 1.55±0.07 ms for group 1, 3.62±1.54 ms for group 2, 2.24±1.06 ms for group 3, and 2.18±1.29 ms for group 4, respectively. The average amplitude of each groups was 14.12±5.30 mV in group 1, 2.76±2.78 mV in group 2, 4.21±2.33 mV in group 3, and 5.78±3.13 mV in group 4, respectively. In the postoperative week 4, the average latency of each groups was 1.59±0.25 ms for group 1, 3.04±0.26 ms for group 2, 2.96±0.68 ms for group 3, and 2.93±0.24 ms for group 4, respectively. The average amplitude of each groups was 17.32±8.87 mV in group 1, 4.64±1.41 mV in group 2, 8.23±2.99 mV in group 3, and 8.13±2.31 mV in group 4, respectively. 2. Comparison of the electromyographic results In the postoperative week 2, the mean number of ASA per 5 seconds was 3.25±1.49 in group 2, 3.75±2.12 in group 3, and 3.50±2.39 in group 4, respectively. (p=0.842) In the postoperative week 4, the mean number of ASA per 5 seconds was 9.38±4.44 in group 2, 4.75±2.25 in group 3, 3.50±1.60 in group 4, respectively. (p=0.138) 3. Pathologic examination Co-localization of skeletal muscles and nerve cells was seen at the pathologic specimen. Neovascularization toward the nerve cells was observed.

Conclusion This study is one of the few preclinical studies demonstrate the electrophysiological effect of RPNI and validate the neural signals through an animal experiment. It is expected that this study will serve as a basis prior study of following nerve interface studies dealing with bionic limbs. However, it is necessary to further study whether the same effect can be shown in clinical trials when there are few prior clinical evidences.|연구 목적 교통사고 및 다양한 스포츠 활동, 서구화 및 고령화로 만성질환 이환율이 올라가면서 사지 말단 절단 유병율은 급격하게 증가하고 있다. 절단 환자는 사회적, 심리적으로 고립되면서 회복 및 재활에 커다란 사회적 비용을 야기한다. 현존하는 말단 절단 환자의 보철은 많은 발전을 이루어 왔으나 이식 혹은 착용 후 실제로 사용하는데 있어서 재활치료 및 꾸준한 트레이닝의 필요성 등 각종 한계를 보이고 있다. 말단 절단 환자는 기능적 상실뿐만 아니라 신경종 형성으로 인한 신경통, 사지 상실에 대한 우울감 등 정신적인 문제로도 장기간 고통받는다. 이에 대한 근본적인 해결책으로 로봇 사지에 대한 적극적인 연구가 각국에서 진행중이다. 로봇 사지는 정교한 움직임을 구현하기 위해 척수, 말단신경, 근육까지의 자연스러운 전기신호 제어가 필수적이다. 착용형 로봇은 이식형보다 재활 및 사용이 간편하지만 피부 표면에서 신경 말단의 전기신호를 받아들이는 모델을 구현하는데 어려움이 있어 여러가지 연구가 활발히 진행중이다. 기존 연구들을 통해 우리는 말초 신경 신호가 말단에서 생체학적으로 증폭이 되어 근전도 신호로 변환된다는 것을 알고 있으며 이를 제대로 기록하고 제어할 수 있다면 상하지 로봇의 직관적 컨트롤이 가능할 것으로 기대하고 있다. 이를 위해 신경 말단에 근육세포를 이식하여 재생 말초 신경 인터페이스(Regenerative peripheral nerve interface, RPNI)를 형성하여 신경 신호를 증폭시키는 기술이 최근 각광받고 있다. 본 연구의 목적은 RPNI의 과학적 근거를 랫드를 이용한 신경신호검사를 통해 입증하는 것이다. 더 나아가 그 효과를 단순 절단 모델의 신호와 비교하고 신경신호 증폭 및 절단 환자의 신경 인터페이스 개발에 대한 과학적 근거를 제공하고자 한다.

연구 방법 총 24마리의 Lewis 랫드 (8주령)을 4군으로 나누었다. 1군 : 대조군 – 좌골신경 박리외에 다른 술기를 시행하지 않은 군 2군 : 단순 신경 절단 모델 – 총비골신경 절단만을 시행한 군 3군 : 신경 인터페이스 모델 – 총비골신경 절단 후 대퇴이두근(biceps femoris) 일부를 이용해 재생 말초 신경 인터페이스(RPNI)를 한 개 만든 군 4군 : 신경 인터페이스 모델 – 총비골신경 절단 후 대퇴이두근(biceps femoris) 일부를 이용해 재생 말초 신경 인터페이스(RPNI)를 두 개 만든 군

1. 랫드의 신경 인터페이스 모델 생성 랫드의 뒷다리에 고관절부터 치골결합까지 이어지는 3cm 길이의 절개를 시행하였다. 심부근막을 열고 대퇴이두근과 대둔근 사이를 박리하여 그 사이에서 비골신경을 박리하였다. 이후 비골신경 말단에 2, 3, 4군에 해당하는 수술을 시행하였다. 1군의 랫드는 해당 신경을 확인한 후 전기생리학적 검사만을 시행한 후 검사결과를 기록하였다. 2. 1차 전기생리학적 검사 신경 인터페이스 모델 생성 직후 좌골신경을 자극하여 랫드의 앞다리 근육 혹은 생성된 신경인터페이스에 TECA Synergy (Viasys healthcare, UK)를 이용해 근전도검사와 신경전도검사를 시행하였다. 검사 시행 후 수술 부위를 Vicryl Rapide (polyglactin 910; Ethicon, Somerville, NJ, USA) 4-0 봉합사를 이용해 각 층을 맞추어 봉합하였다. 3. 2차 전기생리학적 검사 수술 후 2주일이 되는 시점에 비침습적 전기생리학적 검사를 한차례 시행하였다. 랫드의 앞다리 근육에 바늘을 꽂아 근전도검사를 시행하여 시간 당 비정상 자발전위 숫자를 구해 결과를 도출하였다. 4. 3차 전기생리학적 검사 수술 후 4주일이 되는 시점에 기존 수술부위를 다시 절개하였다. 비골신경 말단 혹은 신경인터페이스 수술 부위를 노출시킨 후 랫드의 앞다리 근육 혹은 신경인터페이스에 근전도검사와 신경전도검사를 시행하였다. 검사결과를 기록하여 1차, 2차 검사결과와 비교하였다. 수술 부위는 첫 수술과 동일한 방법으로 봉합하였다. 5. 병리조직 채취 신경인터페이스에서 병리조직을 채취하여 조직 검사 및 검경을 시행하였다. 6. 통계 분석 각 그룹 간 검사결과의 유의한 차이가 잇는지 확인하기 위해 대응표본t검정으로 p-value를 확인하였다. 추가적으로 다그룹간 평균 비교를 위해서는 비모수 검정법인 독립 K 표본(Kruskal-Wallis test) 통계법을 사용하였다.

결과 1. 신경전도검사 결과의 비교 각 군별 수술 직후 신경전도검사의 잠복기 평균은 1군이 1.55±0.07 ms, 2군이 3.62±1.54 ms, 3군이 2.24±1.06 ms, 4군이 2.18±1.29 ms 이었다. 신경 신호 진폭의 평균은 1군이 14.12±5.30 mV, 2군이 2.76±2.78 mV, 3군이 4.21±2.33 mV, 4군이 5.78±3.13 mV 이었다. 수술 시행 4주 후 재시행한 신경전도검사의 잠복기 평균은 1군이 1.59±0.25 ms, 2군이 3.04±0.26 ms, 3군이 2.96±0.68 ms, 4군이 2.93±0.24 ms 이었다. 신경 신호 진폭의 평균은 1군이 17.32±8.87 mV, 2군이 4.64±1.41 mV, 3군이 8.23±2.99 mV, 4군이 8.13±2.31 mV 이었다. 2. 근전도검사 결과의 비교 수술 시행 2주 후 시행한 근전도검사에서 5초 당 비정상 자발전위의 발생횟수 평균은 2군이 3.25±1.49 회, 3군이 3.75±2.12 회, 4군이 3.50±2.39 회 이었다. (p=0.842) 수술 시행 4주 후 시행한 근전도검사에서 5초 당 비정상 자발전위의 발생횟수 평균은 2군이 9.38±4.44 회, 3군이 4.75±2.25 회, 4군이 3.50±1.60 회 이었다. (p=0.138) 3. 병리조직 검사 결과 수술 후 4주 뒤 채취한 신경인터페이스 병리조직에서 근육세포와 신경세포가 섞여서 존재하는 것이 확인되었으며 신경세포 쪽으로 신생혈관증식 소견이 관찰되었다.

결론 본 연구는 신경 말단에서 근육 이식절편을 이용해 만든 재생 말초신경 인터페이스를 동물실험에서 입증한 몇 안되는 연구 중 하나로, 활발하게 진행되고 있는 신경 인터페이스 연구들의 선행연구로 역할을 할 수 있을 것으로 기대한다. 재생 말초 신경 인터페이스는 신경말단의 재신경화를 유도하고 신호를 증폭할 수 있다는 점에서 추후 바이오닉 림과 절단 말단의 연결에 유용한 도구로 사용될 수 있다. 다만 선행된 임상 연구가 거의 없는 상황에서 실제 임상에서 동일한 효과를 나타낼 수 있을지는 추가 연구가 필요한 부분이다.