CEA 발현 암세포에서 재조합 면역 독소 CEA (scFv) -PE26의 세포 독성 효과

Abstract

Pseudomonas exotoxin A (PEA)는 녹농균이라는 그람-음성 간균에서 기원한 독소이며, 세포 내 단백질 합성에 관여하는 신장인자2(elongation factor 2)를 리보실화함으로써 단백질 합성을 방해하여 세포사멸을 일으키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 기존에 38 kDa으로 잘라 사용했던 PEA를 26 kDa으로 더 작게 만들어 혈관누출증후군을 좀 더 보완할 뿐만 아니라, B cell과 T cell의 항원 결정부위를 제거하여 자체 면역원성을 줄이되 그 독성을 유지할 수 있도록 디자인 하였으며 이러한 독소를 암 특이적으로 발현 하는 발암배아성 항원 (Carcinoembryonic antigen, CEA)와 scFv를 연결하여 표적화된 면역독소를 디자인 하였다. 이를 효율적으로 생산하기 위하여 헥사히스티딘 말토스 결합 단백질 (HIS6-MBP)을 포함한 발현벡터를 제작하였고 BL21(DE3), SHuffle 그리고 Origam2와 같은 대장균에서 His6-MBP-CEA(scFv)-PE26 의 과발현을 유도하였으며 그 중 가장 발현률이 높은 BL21(DE3)를 선택하였다. 과발현된 벡터를 가지고 친화 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정제하였고 최종적으로 2 L의 배양액에서 약 12.6 mg의 CEA(scFv)-PE26가 얻어졌다. 이렇게 정제된 면역독소를 사용하여, CEA 발현에 따른 세포독성 비교를 진행하였다. 세포독성 평가를 진행하기 전에, 여러 암세포주 (위암 세포주; MKN45, 대장암 세포주; SNU-C4, HCT116 및 간암세포주; HepG2)에서 CEA 단백 발현율을 Western Blot 과 Real time PCR을 이용하여 조사한 결과 MKN45 세포주에서만 CEA 발현율을 보였으며, 다른 세포주에서는 CEA 발현이 매우 작아 검출되지 않았다. 또한 CEA 발현이 다양한 암세포들에 CEA(scFv)-PE26를 72시간 동안 처리했을 경우의 세포생존율을 조사하기 위하여 MTT assay를 진행하였다, 그 결과 동일 농도 10 µg/mL 에서 MKN45 세포주의 세포 생존율이 약 20% 까지 유의성 있게 감소되었으며 이와는 반대로 SNU-C4는 70%, HCT-116은 90% 가량의 세포생존율을 보였다. MKN45의 IC50 수치는 1.62 ± 0.85 ng/mL로 기존의 다른 재조합면역독소가 갖는 IC50수치보다 낮아 저농도로도 치료효과를 볼 수 있음을 시사한다. 더 나아가 면역독소가 CEA 발현 특이적으로 결합하는지를 확인하기 위하여 MKN45, SNU-C4, HCT-116 및 HepG2에 CEA(scFv)-GFP를 처리하여 FACscan을 진행한 결과, CEA발현율이 높았던 MKN45에서만 green fluorescence 파장의 증가를 볼 수 있었으며 다른 세포주에서는 파장의 증가를 의미하는 그래프 축의 이동을 볼 수 없었다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 재조합 면역독소인 CEA(scFv)-PE26는 CEA에 특이적으로 발현되는 암을 표적화하는 표적항암제로서의 가치를 기대해 볼 수 있다.|Pseudomonas exotoxin A (PEA) is derived from the gram-negative bacillus Pseudomonas aeruginosa. This toxin interferes with protein synthesis via the ribosylation of EF-2 (Elongation factor 2) and thereby causes apoptosis. In the present study, I designed a recombinant immunotoxin (RIT) derived from PEA that would retain specific cytotoxic capabilities but not cause non-specific adverse events such as vascular leak syndrome. This engineered RIT comprised 26 kDa of the full length PEA of 38 kDa. This truncated form lacked the B cell and T cell epitopes present in the native protein so that it would have reduced immunogenicity whilst maintaining its toxicity. Moreover, I generated a more targeted immunotoxin via the addition of an scFv fragment that is specific for carcinoembryonic antigen (CEA), which is overexpressed on the surface of diverse carcinoma types relative to normal cells. To efficiently produce and purify this RIT, a bacterial expression vector was used that contained a hexahistidine-maltose binding protein (His6-MBP) tag. The BL21(DE3) E.coli strain was used to produce the protein from which the overexpressed fusion product, his6-MBP-CEA(scFv)-PE26, was purified using affinity chromatography. I achieved a yield of 12.6 mg of CEA(scFv)-PE26 from a 2 L culture. I tested the growth effects of this RIT in the gastric cancer cell line, MKN45, and colon cancer cell lines, SNU-C4 and HCT-116; and the liver cancer cell line, HepG2 . The viability of the MK45 cell line, which is the only one of the four tested that overexpresses CEA, was significantly reduced to about 20%. In contrast, the SNU-C4 and HCT-116 cells showed a 70% and 90% viability level, respectively, after exposure to CEA(scFv)-PE26 . The IC50 value in the MKN 45 cells for this RIT was 1.22 ± 0.56 ng/mL (n=3), which is lower than that reported for other RIT molecules. I also confirmed by flow cytometry analysis that my novel immunotoxin binds specifically to the CEA expressed on the MKN45 cell surface but does not interact with the other cell types that were analyzed. In conclusion, CEA(scFv)-PE26 is a novel RIT that shows potential as a future anticancer drug that can specifically target CEA-expressing cancer cell.