Epigallocatechin-3-gallate가 대동맥 내피세포에서 TLR4의 세포외영역 절단을 통해 갖는 LPS에 대한 억제 효과

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연구배경: Toll-like receptor 4 (TLR4)는 선천성 면역에 중요한 조절자이며, 염증, 자가면역질환, 암, 신경정신병 등에 중요한 역할을 한다. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)는 녹차잎에 가장 풍부한 폴리페놀로 TLR4의 발현을 감소시키거나 TLR4 신호체계를 막는다고 알려져 있으나 EGCG가 TLR4의 활동을 조절하는 기전은 잘 정립되어 있지 않다. 본 연구에서는 사람동맥내피세포에서 EGCG가 TLR4의 세포외 영역절단을 일으키는지를 조사하였다.
방법: 배양된 사람동맥내피세포에서 TLR4의 발현은 웨스턴 블롯을 통해 조사하였다. 세포내 칼슘 레벨은 Fluo-4 AM을 통해 측정하였고, A disintegrin and metalloprotease 10 (ADAM10)의 역할은 siRNA와 면역형광법을 통해 알아보았다.
결과: 지질다당류에 의한 ICAM-1의 발현이 EGCG에 의해 감소되었다. EGCG는 용량, 시간 의존적 양상으로 사람동맥내피세포의 TLR4의 발현을 감소시키고 사람동맥내피세포 배지의 TLR4의 아미노말단 정도를 증가시켰다. 세포내 칼슘 킬레이터제인 BAPTA-AM은 EGCG에 의한 TLR4의 세포외영역 절단을 막았다. 세포외 칼슘이 없어도 EGCG는 여전히 세포내 칼슘 레벨을 증가시켰으나 그 효과는 약간 감소하였다. EGCG 처리를 하면, 세포 표면의 ADAM10의 발현이 증가되었다. BAPTA-AM은 EGCG에 의한 ADAM10의 세포표면으로의 이동을 억제하였으나, 세포외 칼슘의 부재는 ADAM10의 이동을 막지 않았다. siRNA로 ADAM10을 고갈시켰을 때 EGCG에 의한 TLR4의 세포외영역 절단이 일어나지 않았고, LPS에 의한 ICAM-1의 발현이 EGCG에 의해 억제되지 않았다.
결론: EGCG는 사람동맥내피세포에서 세포내 칼슘 농도를 올림으로써 ADAM10을 통해 TLR4의 세포외영역 절단을 일으킨다.|Background: Toll-like receptor 4 (TLR4) is an important regulator of innate immunity, with roles in inflammation, autoimmune disease, cancer, and neuropsychiatric disease. Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), the most abundant polyphenol in green tea leaves, has been shown to decrease the expression of TLR4 and inhibit TLR4 signaling, but the mechanism through which EGCG regulates TLR4 activity is not well-characterized. In this study, we explored whether EGCG causes ectodomain shedding of TLR4 in human aortic endothelial cells (HAECs).
Methods: TLR4 expression in cultured HAECs was assessed by Western blotting. Intracellular Ca2+ levels were measured using Fluo-4 AM, and the role of A disintegrin and metalloprotease 10 (ADAM10) was characterized using siRNA and immunofluorescence.
Results: Lipopolysaccharide (LPS)-induced ICAM-1 expression was attenuated by EGCG pretreatment. EGCG decreased HAEC expression of TLR4 and increased the levels of the N-terminus of TLR4 in HAEC culture media in a dose- and time-dependent manner. BAPTA-AM, an intracellular Ca2+ chelator, prevented EGCG-induced ectodomain shedding of TLR4. In the absence of extracellular Ca2+, EGCG still increased cytosolic Ca2+ levels, but the effect was reduced. With EGCG treatment, ADAM10 expression at the cell surface increased. BAPTA-AM inhibited EGCG-induced translocation of ADAM10 to the cell surface, but the absence of extracellular Ca2+ did not block ADAM10 translocation. ADAM10 depletion with siRNA prevented EGCG-induced ectodomain shedding of TLR4, and LPS-induced ICAM-1 expression was not inhibited by EGCG in the absence of ADAM10.
Conclusion: EGCG induces ADAM10-mediated ectodomain shedding of TLR4 in HAECs by increasing the cytosolic Ca2+ concentration.
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일반대학원 의학과
울산대학교 일반대학원 의학과
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Medicine > 2. Theses (Ph.D)
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