Staphylococcus aureus의 fusidic acid 내성 유전자형과 분자역학적 형별의 연관성

Abstract

Fusidic acid is an antibiotic that has been used for the treatment of skin and soft tissue infection or bone and joint infection caused by gram-positive organisms including Staphylococcus aureus. Fusidic acid works by interfering with bacterial protein synthesis, specifically by preventing the translocation of the elongation factor G (1) from the ribosome. Major fusidic acid resistance determinants are an alteration of the binding site (fusA or fusE=rlpF) or acquired fusidic acid resistance (fusB, fusC, and fusD). The prevalence of fusidic acid resistance in methicillin-susceptible S. aureus (MSSA) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) were stratified by sequence type (ST) and spa type. The breakpoint of fusidic acid resistance was 16 μg/ml in this panel, however, fusidic acid MIC values ≥ 2 μg/ml is considered to be resistant according to the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) breakpoints. There were two types of fusidic acid resistance, Low level- resistance (2 < MIC ≤ 32 μg/mL) and high level-resistance (MIC ≥ 64 μg/mL). In addition, The prevalence of fusidic acid resistance mechanisms was aimed to determine. Also, The distribution of fusidic acid resistance determinants was examed. From 2014 to 2018, S. aureus bloodstream isolates were collected in Asan Medical Center, Seoul, Republic of Korea. Isolates were examined for the presence of resistance determinants and examined for fusA mutation and fusE mutation. A total of 550 S. aureus (236 MRSA and 314 MSSA) isolates, the rate of fusidic acid resistance was 41% in MRSA and 37% in MSSA. Of these, 90 of 119 ST5-MRSA isolates were resistant to fusidic acid, whereas 43 of 52 ST72-MSSA were resistant to fusidic acid. substitutions in EF-G were detected, L461K alteration was predominant and only 4 isolates showed other single amino acid substitutions (V90I, N463S, P404L, and R483C). In this study, fusidic acid resistance was dominant in ST5-MRSA and ST72-MSSA with the predominance of fusA mutation in high resistance. Also, fusidic acid resistance was common in ST1-MSSA with the predominance of fusC acquisition in low resistance. In this study, ST5-MRSA- II-t2460 was a predominant clone, accounting for 43 % (39/90) of fusidic acid-resistant ST5-MRSA isolates. Secondly, ST5-MRSA- II-t9353 one of major, accounting for 13% (12/90) of fusidic acid-resistant ST5-MRSA isolates. Among 4 fusidic acid resistance, MRSA isolates, 4 belonged to ST5-MRSA-II-t002 clones carrying fusC with low-level fusidic acid resistance. In this study, The prevalence of fusidic acid resistance in MSSA and MRSA stratified by ST and spa type was investigated. In addition, The prevalence was aimed to estimate of fusidic acid resistance determinants.|연구배경: 황색포도알균(Staphylococcus aureus)은 지역사회와 병원 감염의 중요한 원인균으로 피부 및 연 조직 감염, 폐렴, 균혈증 등을 일으킨다. 카테터 또는 인공 기구의 사용 및 침습적 시술이 늘면서 황색포도알균에 의한 심각한 감염이 증가하고 있으며, 이들 균주들은 기존 항생제에 대해 내성을 보이는 경우가 많아 적절한 항생제 치료가 어려워지고 있다. Fusidic acid 항생제는 황색포도알균 등의 그람 양성균에 의해 발생하는 피부 및 연조직 감염 또는 뼈 및 관절 감염의 치료에 사용되는 항생제이다. Fusidic acid 항생제는 세균의 단백질 합성을 방해함으로써 특히 리보솜에서의 신장 인자 G (EF-G)의 전좌를 막아 작용한다. 주요 fusidic acid 내성 결정 인자는 결합 부위의 변화 (fusA 또는 fusE = rlpF) 또는 fusidic acid의 내성 획득(fusB, fusC 및 fusD)이 있다. 본 연구는 메티 실린 내성 황색 포도상 구균 (MRSA) 과 메티 실린 감수성 황색 포도상 구균 (MSSA)의 fusidic acid 내성의 유병률을 시퀀스 유형 (ST) 및 스파(spa) 유형에 따라 조사하였고 또한 fusidic acid 항생제의 내성 결정인자들의 분포도를 조사하였다. 본 연구는 항생제 내성 문제를 정확하게 파악하기 위해서는 항생제에 내성인 균주들의 다양한 타입에 따른 균주 파악과 내성에 따른 유병률을 평가하는 것을 목표로 하였다.

연구방법: 2014년부터 2018년까지의 서울아산병원에서 등록된 550명의 중복되지 않은 균혈증 환자의 혈액으로부터 236개의 MRSA 균주 그리고 314개의 MSSA 균주를 수집했다. 각 수집된 균주들은 전부 MLST sequence type 그리고 spa type를 확인하였고. 결정된 ST에 따라 분류된 균주들을 대상으로 European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) 가이드라인에 근거하여 Minimum inhibitory concentration (MIC, 최소억제농도) 검사를 통하여 내성 균주들을 선별하였다. 선별된 균주들을 대상으로 내성기전을 파악하기 위하여 nucleotide 서열 및 추론 된 아미노산 서열을 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)를 통해 비교 분석하였다.

연구결과: 결과적으로 236개의 MRSA 균주 중에서 97개(41%) 그리고 314개의 MSSA 균주 중에서 116개(49%)가 내성 균주로 분리되었다. Fusidic acid에 내성을가진 S. aureus 모든 균주에서 fusA gene 그리고 fusE gne이 발견되었고, 내성 기전을 확인하기 위해서 fusA mutation 부위를 확인한 결과 MRSA의 균주 90개(ST5: 84, ST72: 6) 에서 L461K 변형이 우세하였으며, 단 4 개의 서로 다른 단일 아미노산 치환 (V90I, N463S, P404L 및 R483C)이 일어났다. 이때 L461K와 N463S는 고도 내성의 결과를 갖는 반면에 V90I, P404L 그리고 R483C는 저도 내성의 결과를 가졌다. 나머지 7균주는 fusC를 얻어 저도 내성의 결과를 가졌다. 반면에 MRSA와 다르게 MSSA에서 fusA mutation 부위를 확인한 결과 ST에 따른 결과가 확연하게 구분되었는데, MSSA의 107개(ST1: 32, ST5: 5, ST72: 43, ST513: 29)에서 ST5, ST72 그리고 ST513의 77개 전부 L461K 변형에 의해서 내성을 일으켰고 이들은 전부 고도 내성의 결과를 나타냈다. 하지만 ST1의 32개는 전부 fusC를 얻어 저도 내성의 결과를 나타냈다. 마지막으로 내성을 갖는 균주들을 대상으로 17개의 spa type의 결과를 확인하였고 ST5-MRSA-t2460, ST72-MSSA-t126, ST1-MSSA-t127 그리고 ST513-MSSA-t164의 결과를 나타냈다.

결론: 이 연구에서, fusidic acid 내성은 ST5-MRSA 및 ST72-MSSA에서 흔했으며 ST5-MSSA 및 ST72-MRSA에서는 드물었다. 전반적으로, Fusidic acid 내성 유병률은 이연구에서 39 %로 낮았는데, 이는 그리스보다 낮았으며 (52.5 %), 다른 유럽 국가들보다 높았다 (1.4 % -19.9 %)8). 뉴질랜드 (29 %)11), 북미 (0.3 % -7.0 %)7). 대한민국에서의 2004 년에 MSSA 내성률은 31.7 %, MRSA 14.1 % 8) 반면, 본실험의 결과는 MSSA 내성률은 37 %이며 MRSA 41 %였다. fusidic acid 내성기전 중에서 FusA 돌연변이 이 가장 흔하게 나타났다(81%) 그리고 유전자 획득에 의해서 내성을 일으키는 건 흔하지 않다(29%). 그러나, 본 실험과는 달리, 유전자 획득에 의해서 내성을 일으키는 건 흔하지 않다 유럽에서 FusA 돌연변이보다 더 흔하다8, 10). 본 발명자들은 t2460 ST5-MRSA가 가장 흔한 클론이고 전부다 내성 이었지만, t324 ST72-MRSA는 가장 흔한 클론 이었지만 대부분이 감수성을 나타내 관찰되었다. 본 발명자들은 t126 ST72-MSSA가 흔한 클론이고 전부다 내성 이었지만, 반면 t179 ST5-MSSA가 가장 흔한 클론이지만 가장 흔한 클론 이었지만 대부분이 감수성을 나타내 관찰되었다. 본연구에서 몇가지 부족한점이 있는데 첫번째로 한국에서의 단일 센터 연구 였기 때문에, 우리의 연구 결과를 일반화하기위한 추가 멀티 센터 연구가 필요하다. 두번째로는 t324 ST72-MSSA, t324 ST72-MRSA, t2460 ST5-MSSA, and t2460 ST5-MRSA의 정확한 비교를 위해서 whole genome 시퀀스 비교가 필요하다.