Rottlerin의 멜라닌 생성 억제에 대한 연구

Abstract

피부와 머리카락의 색은 피부조직에 있는 두 종류의 멜라닌의 정도와 비율에 의하여 결정이 된다. 이는 환경적인 자극과 피부에 있는 두 종류의 세포인 멜라닌 세포와 케라틴 세포의 상호작용을 포함한 과정으로 조절이 된다. 피부 조직은 광범위한 외부의 자극으로부터 최전방에서 인체를 보호하는 기관이다. 멜라닌은 피부조직에 존재하는 멜라닌 세포로부터 합성되어 자외선, 활성산소와 같은 직접적 노출로 인한 피부조직의 보호 기능을 하는 중요 물질이지만, 불규칙적 과색소합성은 주근깨, 기미흑피증 같은 과색소침착 질환의 원인이 된다. 본 연구는 CREB이 전사 과정을 통하여 멜라닌 생성 관련 유전자인 티로시나제, DCT, Tyrp1의 발현에 중추적 역할을 하는 MITF의 발현을 직접적으로 조절한다는 예비 연구 결과를 바탕으로 약물 스크리닝을 통하여 CREB의 전사기능억제제를 발굴하였고, 그 중에 발굴된 약물인 rottlerin의 MITF 발현 및 멜라닌 합성 억제 기능을 확인하며, 안전성, 및 작용 기전을 밝혀 향후 임상적 응용에의 가능성을 검증하는 것을 목표로 하였다. CREB의 전사 활성 리포터로 연구실에서 사용하는 EVX1-luciferase를 293T 세포에 transfection 한 후 약물 라이브러리를 처리하여 luciferase의 발현이 줄어든 약물을 스크리닝하였다. 이와 독립적으로 B16F10 흑색종세포주에 약물을 처리하여 멜라닌 생성의 감소를 유도하는 약물의 스크리닝을 수행한 결과 CREB 전사 활성 감소시키면서 동시에 멜라닌 생성을 감소시키는 약물로 rottlerin을 발굴하였다. Rottlerin의 농도에 따른 B16F10 흑색종세포주에서의 멜라닌 측정을 통해서 약물의 멜라닌 생성 감소 효과를 확인하였고, 약물에 따른 세포생존율을 확인하기 위한 mel-ab 세포에서 MTT를 이용한 실험을 실시하였다. 또, mel-ab세포에 rottlerin과 forskolin을 개별적 그리고 함께 처리하여 B16F10 흑색종세포와 일반 멜라닌 세포에서의 멜라닌 감소 효능을 확인하였다. Rottlerin의 멜라닌 생성 억제 기전 연구를 위하여 western blot을 통해 Raptor, CRTC3, CREB, AMPK 등과 같은 단백질의 신호전달체계를 확인하였고, 멜라닌 생합성과 관련되어 있는 MITF, 티로시나제, Tyrp1, DCT의 발현을 확인하였다. MITF reporter, 티로시나제 reporter와 qRT-PCR 을 이용하여 rottlerin의 멜라닌 생합성 관련 유전자 발현 조절 기전을 확인하였으며, CREB/CRTC3에 대한 의존성을 확인하기 위하여 CRTC3 knockdown 세포를 구축하여 rottlerin의 멜라닌 감소 효능을 비교하였다.