Effects of Chloromethylisothiazolinone/Methylisothiazolinone (CMIT/MIT) in atopic dermatitis mice model

Abstract

배경 및 목적: 아토피피부염은 만성 염증성 피부질환으로 유전적 요인과 함께 다양한 환경적인 요인의 상호작용이 면역체계에 영향을 주어 발생하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 환경적인 요인, 특히 화장품 및 세정제 등에 이용되는 새로운 화학물질의 노출이 아토피피부염 증가의 주된 요인 임이 밝혀지고 있다. Chloromethylisothiazolinone/Methylisothiazolinone(CMIT/MIT)은 방부제와 살균제 용도로 이용되고 있는 화학물질 중 하나로 위생용품뿐 아니라 각종 화장품 및 세탁 용품에 이르기까지 다양한 제품에 광범위하게 이용되고 있다. 최근에는 CMIT/MIT가 경구, 피부 등의 경로로 쉽게 인체로 노출되며 피부 증감제와 자극물로 분류되어 알레르기 접촉성 피부염과의 관련성과 직업성 천식 증례도 보고되었다. 이는 CMIT/MIT가 알레르기 반응을 일으킬 가능성을 시사하여 주고 있다. 그러나 아직까지 CMIT/MIT가 아토피피부염 발생 및 악화에 영향을 미치는지에 대한 연구는 아직 부족하다. 따라서, 본 연구는 아토피피부염 동물 모델을 이용하여 지속적인 CMIT/MIT의 노출을 통해 아토피피부염 발생 및 악화에 대한 영향과 그에 따른 기전을 규명하고자 한다.

연구재료 및 연구방법: 5주령의 암컷 BALB/c 마우스 등에 털을 제거한 후 CMIT/MIT(0.1875mg/kg)를 하루에 1번씩 총 3주 동안 피부 도포를 통해 노출시켰다. 8주령이 되었을 때 난 알부민 (ovalbumin, OVA) 항원을 피부에 적용시켜 항원 감작을 통한 아토피피부염 유발을 시행하였다. 아토피피부염의 증상을 확인하기 위하여 피부의 수분 손실량 (TEWL)과 피부 발적 및 홍반 등 임상증상 정도를 점수화 (Clinical score) 하여 평가하였으며, 마우스의 피부 조직에서 H&E 염색을 통해 염증세포 침윤 정도를 확인하였다. 또한 전신 면역 유발 정도를 확인하기 위하여 혈청 내 총 immunoglobulin(Ig)E와 항원 특이 IgE를 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 기법을 통해 측정하였고, 피부 내 염증 발생과 관련한 사이토카인인 Thymic stromal lymphopoietin (TSLP)와 T helper (Th)2 사이토카인인 interleukin(IL)-4, IL-13, Th17세포에서 분비되는 염증 사이토카인인 IL-17A를 qPCR을 이용하여 측정하였다.

연구결과: CMIT/MIT의 단독 노출의 영향을 정상 마우스에서 확인한 결과, PBS만 도포한 군에 비하여 CMIT/MIT 노출군에서 TEWL, 혈청 내 IgE 농도가 유의하게 증가함을 확인하였고 피부 조직 내 염증의 침윤 정도도 심해짐을 관찰하였다. 또한, CMIT/MIT 노출 군에서 피부 내 TSLP 및 IL-13의 발현량이 유의하게 증가하였으며, 피부 림프절에서 CD4+IL-4+의 유의한 증가를 보였다. 다음으로 아토피피부염 마우스 모델을 통해 CMIT/MIT의 영향을 확인하였다. OVA 단독으로 아토피피부염을 유발한 군에 비하여 CMIT/MIT 노출 후 아토피피부염을 유발한 군에서 TEWL, clinical score가 증가하였고, 피부 조직에서 표피층의 두께 증가 및 진피층까지 염증세포의 침윤 정도가 심해짐을 확인하였다. 또한, OVA 단독 아토피피부염 유발군에 비하여 CMIT/MIT가 노출된 아토피피부염 유발군에서 혈청 내 총 IgE의 농도가 유의하게 증가함을 확인하였으나 항원 특이 IgE 농도에서는 차이를 보이지 않았다. 다음으로 피부 내 염증과 관련된 사이토카인의 발현량을 확인한 결과, 아토피피부염 비유발군에 비하여 CMIT/MIT 노출군, 아토피피부염 유발군 및 CMIT/MIT 노출 후 아토피피부염 유발군 모두에서 TSLP, IL-4 및 IL-17A의 발현량이 증가함을 확인하였다, 특히, 단독 아토피피부염 유발군과 비교하여 CMIT/MIT 노출 후 아토피피부염 유발군에서 IL-4와 IL-17A의 발현량이 증가함을 확인하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 또한 피부 림프절에서는 아토피피부염 유발군에 비하여 CMIT/MIT 노출 후 아토피피부염 유발군에서 CD4+IL-4+와 IL-17A 세포의 유의한 증가를 보였다.

결론: 본 연구결과, CMIT/MIT 노출은 환경항원으로 작동하여 면역 시스템에 영향을 끼쳐 Th2/Th17 반응을 유도한다. 아토피피부염 마우스 모델에서 CMIT/MIT의 지속적인 노출은 Th2/Th17 면역 반응과 관련하여 아토피피부염 악화에 영향을 줄 가능성이 있다.

중심단어: 아토피피부염, Chloromethylisothiazolinone, Methylisothiazolinone, Skin exposure, T helper 2, T helper 17 |Background: Atopic dermatitis (AD) is a chronic inflammatory skin disease characterized by immune mediated inflammation and epidermal barrier dysfunction. Recently, exposure to many environmental factors such as air pollution, construction materials and harmful chemical substances has been found to cause AD. Mixture of chloromethylisothiazolinone (CMIT) and methylisothiazolinone (MIT) is widely used as a biocide, liquid detergent, and cosmetics, and used for humidifier disinfectants because of its strong bactericidal activity and low toxicity. CMIT/MIT exposure has been associated with allergic contact dermatitis, occupational asthma and lung injury. Despite of the association with allergic response, there was no study to investigate the effects of exposure to CMIT/MIT on the development of AD.

Objective: We aimed to investigate the influence of skin exposure to CMIT/MIT on major symptoms of AD and a biological mechanism through an assessment of immune responses in AD mice model.

Methods: BALB/C mice were exposed to skin with CMIT/MIT of 0.1875 mg/kg/day, 5 days/week for 3 weeks and then AD was developed by ovalbumin (OVA) epidermal sensitization. To assess AD symptoms, we measured transepidermal water loss (TEWL) and scored erythema, scaling, and excoriation in dorsum lesions. Total immunoglobulin (Ig) E and OVA specific IgE in serum and histopathological changes in skin were analyzed. To evaluate the immune response, the levels of T helper (Th) 2/Th17-related cytokines such as thymic stromal lymphopoietin (TSLP), interleukin (IL) -4, IL-13 and IL-17A were detected using real-time PCR. The frequency of CD4+IL-4+ and IL-17A producing cells in skin draining lymph nodes was assessed using flow cytometry.

Results: CMIT/MIT skin exposure in mice significantly increased AD-like phenotypes (e.g., TEWL, clinical score, total serum IgE level and inflammatory cells) and skin mRNA expression level of Th2-related cytokines (TSLP and IL-13) significantly increased. In addition, CMIT/MIT skin exposure in mice significantly enhanced CD4+IL-4+ cells in skin draining lymph nodes. Mice exposed to CMIT/MIT in OVA challenge model had higher TEWL, clinical score, and skin inflammation than mice exposed to that. In addition, mice exposed to CMIT/MIT had higher total serum IgE, TSLP, IL-4 and IL-17A in skin mRNA expression and higher population of CD4+IL-4+ and IL-17A producing cells in skin draining lymph nodes than mice unexposed to that.

Conclusion: These findings demonstrated that CMIT/MIT acts as environmental antigen and enhances allergic inflammation by modulation of Th2/Th17 response in AD mice, suggesting that CMIT/MIT skin exposure might aggravate AD symptoms through dysregulation of immune response.

Key words: Atopic dermatitis, Chloromethylisothiazolinone, Methylisothiazolinone, Skin exposure, T helper 2, T helper 17