Correlation of Histological Changes and Nuclear Hormone Receptor Activation in the Rat Liver after Rosuvastatin Calcium Administration

Abstract

본 연구는 SD 랫드 간에서 rosuvastatin calcium이 간세포 비대(centrilobular hypertrophy)와 관련된 CYP 효소 (CYP1A, CYP2B, CYP3A, 그리고 CYP4A) 중 어떤 CYP 효소를 유도하는지 규명하고자 진행되었다. 시험군은 대조군(0.5% hydroxypropyl cellulose 부형제 투여군), rosuvastatin calcium 100 mg/kg 투여군(저용량군) 및 200mg/kg 투여군(고용량군) 총 3군으로 설정하였으며 총 30마리의 SD 랫드를 군 당 10마리씩 3군으로 임의적으로 배정하였다. 7일 간 경구 반복투여를 실시하였으며 마지막 투여일로부터 하루 뒤 부검을 실시하여 체중 및 간 중량을 측정하였고 혈청, 간 검체를 수집하였다. 혈청 생화학 검사를 실시하여 혈청 검체의 혈청 아스파르테이트 아미노전달효소(AST) 및 알라닌 아미노전달효소(ALT) 수치를 측정하였고 간에 대한 조직병리학적 검사를 수행하였다. 핵 호르몬 수용체인 AhR, CAR, PXR, 그리고 PPAR α 활성에 따라 유도되는 각각의 CYP 효소들(CYP 1A, CYP2B, CYP3A, 그리고 CYP4A )에 대한 immunohistochemistry (IHC) 분석을 실시하였다. real-time quantitative PCR (RT-qPCR)분석을 실시하여 CYP 1A, CYP2B, CYP3A, 그리고 CYP4A의 mRNA 수준을 분석하였다. 실험 결과, 절대적, 그리고 상대적 간 중량이 고용량 투여군에서 통계학적으로 유의하게 감소하였다. rosuvastatin calcium 투여군에서 혈청 glucose 및 cholesterol이 통계적으로 유의하게 증가하였고AST 및 ALT 수치가 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 조직병리학적 검사 결과, rosuvastatin calcium 투여군에서 간세포 비대 소견은 관찰되지 않았지만, 효소 유도와 관련 있을 수 있는 간세포의 핵 대소부동증(anisokaryosis) 및 세포질의 호산성 변화 (cytoplasmic eosinophilic change) 소견이 유의하게 확인되었으며 추가적으로 핵응축(pyknosis) 또는 핵붕괴(karyorrhexis), 그리고 세포자멸사(apoptosis) 소견이 동반되었다. IHC 분석 결과, rosuvastatin calcium 투여군 간에서CYP1A, 그리고 CYP2B에 대한 양성 염색 정도가 용량 의존적으로 감소한 반면에 CYP4A에 대한 양성 염색 정도는 용량 의존적으로 증가하였다. RT-qPCR 분석 결과, rosuvastatin calcium 투여군에서 CYP1A2, CYP2B1, CYP2B2, CYP3A2, CYP3A9의 mRNA 수준이 용량의존적으로 감소함과 동시에 통계적으로 유의한 차이가 확인되었지만, CYP1A1, CYP4A1, CYP4A3의 mRNA 수준의 경우 뚜렷한 경향이 관찰되지 않았으며 군 간의 통계적인 유의한 차이는 확인되지 않았다. 본 연구에서 Rosuvastatin calcium 투여에 따라 나타난 혈청 AST, ALT 증가 및 간세포 세포질의 호산성 변화, 그리고 간세포 핵의 대소부동증 소견은 간세포 비대와 함께 효소 유도와 함께 동반되어 나타날 가능성이 높은 병변으로, 이에 따라 rosuvastatin calcium이 SD 랫드 간에서 효소 유도를 일으키는 것을 시사한다. IHC, RT-qPCR 분석 결과를 종합적으로 고려한 결과, rosuvastatin calcium 이 랫드에서 PPAR α을 직접적으로 활성화시켜 CYP4A 유도에 관여한 것으로 사료된다. 결론적으로, 랫드 간에서의 rosuvastatin calcium 투여에 따른 조직학적 변화들은 PPAR α 활성과 상관관계가 있는 변화인 것으로 판단되며, 이에 따라 본 조직학적 소견들이 설치류 특이적이고, 사람과의 연관성이 매우 낮은 변화일 가능성이 시사된다. 간 중량 감소 및 혈청 glucose 수치 감소 소견과 함께, IHC와 RT-qPCR 분석에서 확인된 CYPs 단백질, 유전자 수준의 용량 의존적인 감소는 예상하지 못한 결과로서, 단기간 동안 과도한 용량의 rosuvastatin calcium투여에 의해 간에서 대사 작용이 급격하게 활성화되고 이에 따라 에너지원, 그리고 대사 효소들의 과도한 소비가 유도되어 나타난 결과로 여겨진다. 간세포 비대 소견의 부재 또한 동일한 이유로 발생했을 가능성이 있는 것으로 판단된다. 이러한 판단 하에, 약물을 단기간 동안 고용량으로 처치하는 경우 핵 호르몬 수용체 활성에 따른 효소 유도가 간세포 비대 소견을 동반하지 않고 발생할 가능성이 시사되며, 신약 개발 초기에 단기 독성 시험 수행 시 간세포 비대 소견에 절대적으로 의존하여 효소 유도 및 핵 호르몬 수용체 활성 여부를 판단하는 일은 지양해야 할 것임이 강조된다.|I designed the in vivo study using rats to determine the correlation between activation of nuclear hormone receptor and histologic changes of liver following administration of rosuvastatin calcium. 5-week-old male SD rats were randomly allocated to vehicle treatment group (Control group), rosuvastatin calcium 100 mg/kg treatment group (Low dose treated group; LOW), or rosuvastatin calcium 200 mg/kg treatment group (High dose treated group; HIGH). Rosuvastatin calcium suspended in 0.5 % HPC vehicle or 0.5 % HPC vehicle was administrated orally once a daily, during 7 days. Body weights of HIGH group were decreased since day 3 after first administration and the liver weights of those group were decreased. Serum glucose and cholesterol levels were dose-dependently decreased and serum AST and ALT levels were dose-dependently increased. The histological changes of hepatocyte including cytoplasmic eosinophilic change, anisokaryosis, pknosis or karyorrhexis, and apoptosis were noted in the rosuvastatin calcium treated groups. At immunohistochemical analyses, marked positive immunostaining for CYP4A was observed in the rosuvastatin calcium-treated groups, which was graded dose-dependently. At real-time quantitative PCR analyses, almost CYPs gene levels were dose-dependently decreased following rosuvastatin calcium administration, but Cyp4a levels were not decreased in predominant dose-dependent manner. In conclusion, rosuvastatin calcium-induced histologic changes in this study are likely to be mediated by PPAR α activation, suggesting that these histologic changes are less relevant to human. However, the results in this study are not sufficient to determine whether rosuvastatin calcium is an activator of PPAR α, due to the phenomenon of CYPs depletion or consumption, considered as results of excessive dose treatment. Accordingly, further studies are needed to evaluate peroxisome proliferation, which is induced species-specifically in rodents by activation of PPAR α, or to analyze which nuclear hormone receptor or CYP was activated by rosuvastatin calcium administration.