감염동물 모델과 분자유전학 분석을 통한 국내 지역사회 획득 메티실린 내성 황색포도알균의 병독성

Abstract

연구목적:1990년 대 중반부터 빠르게 증가하고 있는 지역사회획득 황색포도알균(community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus, CA-MRSA)는 기존의 병원 내 MRSA 균주와 달리 높은 병독성을 가졌고 각 국가와 지역별로 다른 유전학적 특징을 갖는 것으로 알려져 있다. 국내에서 주로 감염을 일으키는 CA-MRSA 균주는 ST72-MRSA-SCCmec IV 유전자형을 갖는 균주이며, 최근 국내 임상연구로 골관절감염과의 높은 연관성을 보였다. 이러한 CA-MRSA에 의한 감염은 치료제가 제한적이고, 사망률이 높아 보건의료 및 사회, 경제적 부담이 매우 큰 상태이다. 새로운 치료제, 예방 백신 개발을 위해서는 복잡한 감염 발병기전에 대한 연구가 선행되어야 하는데 국내 ST72-MRSA에 대한 감염 병인에 대한 연구는 매우 드물다. 따라서 동물 균혈증 및 골수염모델로 ST72-MRSA 병독성 확인, 실시간 역전사중합효소연쇄반응(real–time RT-PCR)과 액체크로마토그래피(High pressure liquid chromatography, HPLC)를 이용한 전사체 분석으로 병독 인자와 관련된 유전자를 확인하고, 이를 결실시킨 결실 변이주를 만들어 CA-MRSA 병인과 관련된 유전자임을 증명하는 연구를 진행하였다. 연구재료와 방법: 쥐 안와주위 정맥에 108 colony dorming uniti(CFU)의 MRSA를 접종하고(ST72-MRSA: 20마리, ST5-MRSA: 20마리), 160시간까지 감염증으로 인한 쥐 사망률과 신장과 심장의 감염 병리 소견을 관찰하였다(쥐 균혈증 모델). 쥐의 대퇴골 중앙 부위에 106 CFU의 여러 MRSA 균주를 접종하고 10일간 감염이 진행되도록 한 후 대퇴골을 분리하여 컴퓨터 단층 촬영 장치인 Micro-Computed Tomography(CT, Skyscan 1172 Aartselaar, Belgium)로 3차원 영상을 얻어 분석하고 골 부피 분석을 시행하였다(쥐 골수염 모델). 채취한 대퇴골의 병리 소견도 관찰하였다. RNA-Seq을 통해 발현이 증가되어 있는 유전자들이 실제 RNA 수준에서도 발현이 증가하는지를 확인하기 위해 정량 real-time RT-PCR과 단백질 수준에서 정량하기 위해 HPLC를 시행하여 병인에 관련되었을 가능성이 있는 유전자를 확인하였다. 특이적 후보 병인인자를 allelic replacement를 이용하여 결실 변이주를 만들어 동물 감염모델을 통해 병독성의 차이를 확인하였다. 결과: 쥐 균혈증 모델에서 ST5-MRSA 균주를 접종한 쥐 20마리는 모두 생존하였으나, ST72-MRSA를 접종한 20마리의 쥐 중 7마리만(35%) 생존했고, 감염 3일 째 신장 및 심장의 병리소견에서 더 심한 염증 반응을 보였다. 쥐 대퇴골 감염 모델에서도 ST72-MRSA 접종 쥐에서 ST5-MRSA 접종 쥐들에 비해 병리소견에서 심한 염증반응을 보였고 대퇴골 3차원 CT영상에서도 심한 골 파괴 및 신생 골 형성 병변을 보임을 확인되었다. RNA-Seq과 real–time RT-PCR을 통한 분석에서 signal transduction protein (TRAP)과 전사조절에 관여하는 유전자(TR, MW2624)의 발현 정도가 유의하게 증가되었으며, 이를 결실시킨 결실 변이주를 이용한 쥐 균혈증 모델과 골수염 모델에서 쥐의 생존율이 늘어나고 병리 염증 소견이 감소하는 것을 관찰하였다. 결론: ST72-MRSA 균주의 골 병독성이 ST5-MRSA 균주보다 높고, ST72-MRSA의 병인에 TRAP, TR (MW2624) 유전자가 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다. 추후 이들의 자세한 기능과 영향을 받는 유전자들에 대한 추가 연구가 필요하다.|In Korea, community-associated MRSA (CA-MRSA) account for 18% of community-acquired S. aureus bacteremia. ST72-MRSA is a dominant CA-MRSA strain in Korea and is significantly associated with bone and joint infection. Our study aim was to find a potential target for antibiotic or vaccine against for CA-MRSA (ST72-MRSA) through a pathogenesis study of ST72-MRSA infection. I established murine bacteremia model and murine femur osteomyelitis model for pathogenesis study of ST72-MRSA and found that ST72-MRSA strain was more virulent than ST5-MRSA. In transcriptomics analysis, I found that TRAP gene, TR gene, and some virulence factors in ST72-MRSA were significantly more expressed (transcribed) than those in ST5-MRSA. I selected TRAP (signal transduction protein) gene and TR (MW2624) gene as the key pathogenetic factors of ST72-MRSA strain. Using allelic replacement method, I constructed each of TRAP gene and TR gene deletion mutant of ST72-MRSA. Using murine bacteremia model and murine femur osteomyelitis model, I compared the virulence (mortality and pathogenetic changes) between wild type ST72-MRSA and TRAP or TR gene deletion mutant strain. TR gene or TRAP gene deletion caused significant reduction in the virulence. Therefore, TR gene and TRAP gene may be significant pathogenetic factors for ST72-MRSA virulence.