각막윤부줄기세포 결핍 토끼 모델에서 효소감응성 세포시트 기반의 인간 각막윤부상피 세포의 이식

Abstract

연구 목표: 배양된 사람 각막 윤부상피세포 시트의 이식은 각막 상피와 시력을 회복하는 것에 효과적이라고 증명된 바 있다. 각막 윤부상피세포의 배양은 여러 방법으로 시행되어왔다. 이에 본 저자들은 효소감응성기반의 새로운 배양 기반을 개발하여, 토끼 윤부줄기세포 결핍 모델을 통해 이 방법의 효과를 확인하고자 하였다. 연구 재료 및 방법: 2~2.5kg나가는 뉴질랜드 토끼 수컷 12마리가 본 연구에서 사용되었다. 토끼 윤부줄기세포 결핍 모델은 윤부상피절제술과 NaOH 0.5mol/L를 30초간 적용한 것을 통해 만들었다. 본 저자들은 토기의 각막 상태를 4주후에 평가하였고 토끼 윤부줄기세포 결핍 모델을 분류하였다. 그 분류는 각막혼탁 및 각막신생혈관의 발생정도로 4단계로 나누어 분류하였다. Carboxymethyl cellulose-dopamine (CMC-DOPA) 가 코팅된 Transwell 이 기증자의 각공막 변연부로부터 얻어진 사람 윤부상피세포 배양에 사용되었고, 배양액은 3일, 5일, 7일후에는 매일 교환되었다. 배양된 사람 윤부상피세포 시트 상태는 조직학적 검사와 면역화학적염색에 의해 평가되었으며, 면역화학적염색방법에 사용된 항체로는 anti-CK12, anti-CK3/2p, anti-p63, anti-Zo-1, anti-CK15, Alexa Fluor 647 혹은 555 혹은 488이 사용되었다. 흉터 조직이 제거된 토끼 각막에 준비된 세포 시트를 이식한 후에, 그 이식 상태를 현미경적 소견, 조직학적 소견, 그리고 면역화학적염색을 통한 소견으로 평가하였으며, 면역화학적염색방법에는 Alexa Fluor 647가 사용되었다. 이러한 평가는 그룹1에서는 2주후에, 그룹2에서는 4주후에 시행되었다. 연구 결과: 총 12마리의 수컷의 12개의 우안이 포함되었으며, 그룹1에는 3개체, 그룹2에는 9개체가 포함되었다. 그룹1에서, 각막 혼탁의 단계는 이식 전에 3.67±0.58 그리고 이식 후 2주째에 3.00±0.00 였으며, 각막 혼탁의 단계는 감소하였으나 통계적인 차이는 없었다 (P = 0.184). 각막 신생 혈관의 단계는 이식 전에 3.33±0.58 그리고 이식 후 2주째에 3.00±0.00 였으며, 각막 신생 혈관의 단계는 감소하였으나 통계적인 차이는 없었다 (P=0.423). 그룹2에서, 각막 혼탁의 단계는 이식 전에 3.78±0.44 그리고 이식 후 4주째에 3.11±0.33였으며, 각막 혼탁의 단계는 감소하였고 통계적인 차이가 있었다 (P = 0.004). 각막 신생 혈관의 단계는 이식 전에 3.11±0.60 그리고 이식 후 4주째에 3.11±0.60 였으며, 각막 신생 혈관의 단계는 차이가 없었다 (P=1.000). 5개체가 조직학적 검사와 면역화학적염색을 통한 검사가 이루어졌으며, 이중 4개체에서 사람 윤부상피세포 시트가 4주간 생존하였다. 결론: 토끼 윤부줄기세포 결핍 모델에서 효소감응성세포시트 기반의 배양된 사람 윤부상피세포 이식은 4주간 각막 혼탁 감소에 효과가 있었다. 또한, 이식된 세포 시트 중 80%에서 4주간 생존해 있었다. 이를 통해 볼 때, 배양된 윤부상피세포 시트의 이식은 향후 윤부줄기세포결핍 치료에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.