광범위 큰 B세포 림프종에서 면역형광다중염색법을 이용한 MYC 단백 발현의 정량적 분석과 예후 분석 및 임상 판독 기준 제시

Abstract

연구배경: 광범위 큰 B세포 림프종 (Diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) 은 비호지킨 림프종에서 약 40% 를 차지하는 흔한 질병이다. DLBCL의 완치율은 표준 항암치료 (R-CHOP; rituximab, cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone) 로 인해 과거에 비해 향상 되었으나, 여전히 약 40%의 환자는 치료에 반응하지 않고 결국 사망한다. 이러한 환자를 예측 및 정의하고, 새로운 치료법을 개발하기 위한 선행 연구에서 MYC 단백의 발현과 DLBCL의 나쁜 예후와의 관련성이 다수 보고 되었다. 그러나 선행연구에서 사용된 면역화학조직염색 (IHC, immunohistochemistry)은 MYC 발현강도의 다양성으로 인해 그 염색상이 다양하다. 이러한 이유로 cut-off value 에 대한 판독자간 불일치로 인해 진단에 적용하는데 어려움이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 발현의 강도를 객관적으로 수치화 할 수 있는 실험 기법과 과학적 근거를 갖는 정량적 분석이 요구 되고 있다. 본 연구는 다중형광염색법을 통한 정량적 이미지 분석 및 임상지표를 종합한 통계 분석을 통해 DLBCL예후 예측에서의 MYC 단백발현 cut-off value 를 도출 하였다.

재료 및 방법: 2007~2012년 사이, 서울아산병원에서 진단받은 DLBCL 환자의 파라핀조직을 대상으로 하였다. 이 중, R-CHOP 이외의 치료를 받은 환자와 원발성 중추신경계 DLBCL환자, TMA (tissue microarray) 를 제작 할 수 없는 작은 양의 조직을 제외한 192예로 TMA를 제작하였다. TMA 면역염색은 항체 마다 파장이 각각 다른 형광물질로 표지 하여, 형광 발현 강도를 정량적으로 측정할 수 있는 Opal다중형광염색법을 이용하였다. 사용된 항체로는 종양 세포에서 MYC단백의 발현을 확인하기 위해 CD20와 MYC 으로 염색하였다. 또한 비 종양 세포인 T 세포를 제외하고 분석 할 수 있도록 CD3 염색을 시행하였다. 염색이 완료된 슬라이드는 Vectra slide scanner (PerkinElmer, Waltham, MA) 가 20 nm 간격으로 촬영한 각 파장 별 이미지를 취합했다. 이미지 분석 프로그램인 inForm™ Tissue Finder™ image analysis software (PerkinElmer, Waltham, MA) 로 정량 된 데이터를 얻었다. MYC 의 발현 강도는 차수로 나열하여, 사분위 수로 나누었다 (0+, 1+, 2+, 3+). MYC 단백 발현 강도와 양성 세포 비율에 따른 환자 집단 간 생존 분석을 시행하여 cut-off value 를 도출했다. 도출 된 cut-off value 를 내부 비교하여 신뢰성을 재확인 했다.

결과: 여러 cut-off value 를 비교 분석 한 결과, MYC 단백발현의 강도가 3+ 이상이며 양성세포비율이 60% 이상인 환자 집단의 생존이 통계적으로 유의하게 나쁜 전체생존율 (overall survival, OS) 을 보였다 (p = 0.04). 무합병증 생존율 (Event-free survival, EFS) 에서는 유의하지 않았으나 예후가 나쁜 경향을 보였다 (P= 0.091). 콕스 회귀 분석으로 위험비를 구해보았다. 그 결과, MYC 단백발현의 강도가 3+ 이상이며 양성세포비율이 60% 이상인 환자 집단의 OS 가 유의하게 위험율이 2.4 배 였으며, EFS 에서도 같은 집단이 유의하게 위험율 2 배 였다 (OS, p = 0.014; EFS, p = 0.032). MYC 단백 발현의 강도가 3+ 이상이며 양성 세포 60% 이상을 cut-off value 로 설정한 후, internal validation 을 시행하였다. 그 결과, 제시한 cut-off value 가 나쁜 예후를 예측 할 수 있는 최선이라는 결과가 재확인 되었다 (p < 0.05).

결론: 본 연구 결과, MYC 단백발현의 강도가 3+ 이상 이며 양성세포비율이 60% 이상인 경우DLBCL의 예후를 가장 잘 예측 할 수 있었다. 이 결과를 기반으로 형광면역염색법의 정량적 분석을 통한 DLBCL 에서의 MYC 단백과 예후 간의 관계를 예측 하는 것을 하나의 cut-off value 로 제시할 수 있다. 종양 세포에서 MYC 의 과발현에 대해서 아직 많이 알려진 바가 없기 때문에 DLBCL 에서 과발현 되고 있는 MYC 의 병태생리를 연구하여 치료법에 반응하지 않는 환자군을 예측하고 그에 알맞은 치료법을 제시하는 기저 연구가 될 수 있다. 또한 AI 를 이용한 새로운 진단 기법을 개발하는데 기반이 될 것 이다.