망막색소상피세포 기능 장애의 분자적 기전 연구

Abstract

망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE)는 부르크막(Bruch's membrane)의 위 층에 놓여있는 육각형의 단세포층으로 색소를 띄는 특징을 가지며 주위조직인 광수용체 및 맥락막 모세혈관층과의 상호작용을 통해 시기능을 수행하는데 중요한 역할을 한다. 또한, 망막색소상피세포는 신체 내에서 광수용(light absorption), 물질 수송(epithelial transport), 시각회로 조절(visual cycle), 식세포작용(phagocytosiss), 호르몬 분비 및 면역조절 작용 등의 기능을 수행한다. 노인성 황반변성 (AMD; Age-related macular degeneration)은 망막의 중심부에 위치한 황반에 이상이 생겨 시력이 급격히 떨어지는 병으로 주로 50세 이상에서 노화로 인해 발생하며 노년기 시력 상실의 주요 원인으로 손꼽힌다. 노인성 황반변증의 정확한 발병 기전은 거의 알려지지 않았지만, 최근 들어 병리생리학 원인으로 망막색소상피세포의 손상과 세포사멸이 관여한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 산화 스트레스, 소포체 스트레스 그리고 타목시펜에 노출되었을 때 망막색소상피세포의 기능 장애와 사멸을 유도하는지와 그 과정에 관여하는 신호전달 분자들에 대한 메커니즘에 대해 알아보고자 하였다. 첫째, 요오드산나트륨(sodium iodate, NaIO3)에 의한 산화 스트레스가 발생하면 망막색소상피세포에서 펜트락신3(PTX3)의 발현이 RT-PCR과 ELISA을 통해, mRNA와 단백질과 수준에서 증가함을 확인 하였다. 또한 산화 스트레스로 인해 증가된 펜트락신3는 활성 산소 종(ROS), AKT와 ERK의 활성화되었고, 이는 각 저해제에 의해 펜트락신3의 발현이 감소됨을 확인 하였다. 뿐만 아니라, 산화 스트레스 상황에서 항산화 효소인 G6PDH, CAT, GSR의 발현은 증가 하였지만, 펜트락신3를 shRNA를 이용해 형질주입 시킨 망막색소상피세포에서는 항상화 효소의 변화가 없었다. 펜트락신3의 가능을 확인 하기 위해 요오드산나트륨의 농도를 높여서 망막색소상피세포의 세포 사멸을 유도한 후, 활성 산소 종, AKT 저해제로부터 세포 생장이 다시 회복 되었다. 추가로, 펜트락신3 shRNA 형질주입 된 망막색소상피세포에서는 높은 농도의 요오드산나트륨을 노출시키자 컨트롤 벡터가 형줄주입 된 세포에 비해 세포 생존률이 현저히 증가 하였다. 마지막으로, 컨트롤벡터가 형질 주입된 세포는 산화적 스트레스 상황에서 노인성 황반변증 마커 유전자인 CFI, CFH, APOE 그리고 TLR4의 발현이 증가되었지만, 펜트락신3 shRNA 가 형질주입 된 세포에서는 유전자들의 발현 변화가 없었다. 위의 결과들은 산화 스트레스 상황에서 발현되는 펜트락신3가 망막색소상피세포의 사멸을 가속화시키는 것을 보여준다. 둘째, 소포체 (Endoplasmic Reticulum, ER)는 칼슘의 저장, 신호전달 그리고 단백질의 폴딩과 운송에 대해 전문화된 세포 내 소 기관으로 세포 내 항상성 및 세포 외 자극의 변화에 매우 민감하다. 소포체 내에 잘못된 폴딩 단백질이 증가하는 소포체 스트레스는 자가포식과 세포 사멸에 밀접하게 연관되어 있다. 망막색소상피세포에서 소포체 스트레스를 유도하게 하는 튜니카마이신(tunicamycin, TM)과 팔미트에시드(palmitic acid, PA)을 이용하여 소포체 스트레스를 유도하게 되자 세포사멸이 일어나게 되고, 자가포식의 마커로 알려진 LC3B와 소포체 스트레스 마커로 세포사멸과 관련된 CHOP 발현이 증가되는 것을 단백질 수준에서 확인 하였다. 또한 RT-PCR을 통해 튜니카마이신 농도에 따른 자가포식 마커 LC3B, p62, ATG5, Beclin1 과 소포체 스트레스 마커 CHOP, GRP78의 발현을 mRNA 수준에서 증가됨을 확인 하였다. 더 나아가 소포체 스트레스로부터 증가된 자가포식의 활성이 소포체 스트레스 저해제(4-PBA)로부터 감소된다는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 소포체 스트레스로부터 활성화된 자가포식의 기능을 확인하기 위해 자가포식 저해제(chloroquine, CQ)를 이용하여 망막색소상피세포의 세포사멸을 확인하자, 저해제로 인해 세포 사멸이 더 촉진 된다는 것을 통해 자가포식은 세포 사멸의 유도를 막는다는 것을 확인 할 수 있었다. 소포체 스트레스로부터 유도되는 자가포식는 니코틴(산)아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(燐酸)(NADP)의 환원형, (NADPH) 산화효소의 신호가 관여 한다는 것을 저해제를 이용하여 확인 할 수 있었으며, 마지막으로 노인성 황반변성 마커들은 소포체 스트레스 유도제로부터 mRNA의 발현이 증가하게 되고 이 때 소포체 스트레스 저해제에 의해 감소한다. 그러나 자가포식 저해제로 인해 다시 마커들의 발현이 회복된다는 것을 확인하였다. 위의 결과들은 소포체 스트레스로부터 유도되는 망막색소상피세포의 사멸을 자가포식의 활성을 통해 이는 세포 사멸을 방어 하는 것을 보여준다. 셋째, 타목시펜(tamoxifen)은 유방암에 사용되는 항에스트로겐 치료제로 안과 질환들의 부작용 등을 발생 시킬 수 있다. 설파살라진(sulfasalazine)은 류마티스관절염, 크론병과 같은 염증성 질환에 사용되는 항 염증제이다. 타목시펜으로부터 망막색소상피세포의 사멸을 유도하는 과정에서 설파살라진이 세포사멸을 억제하는 것을 MTS와 LDH assay를 통해 확인 할 수 있었다. 또한 타목시펜으로 인한 세포 사멸에서 다양한 세포 과정 중 어떠한 신호분자들이 관여하는지를 알아보기 위해 mRNA와 단백질 수준에서 확인하였다. 결과적으로, 자가포식 대표 마커인 LC3B와 세포 사멸의 마커인 인산화된 JNK, caspase3의 발현이 타목시펜에 의해 증가하였고, 이 때 설파살라진이 증가된 LC3B, 인산화된 JNK, caspase3의 발현을 감소시켰다. 타목시펜으로 활성화된 자가포식 과정에서 자가포식 저해제(chloroquine, CQ)로 인해 세포 사멸이 억제 되고, 자가포식 유도제(rapamycin)로부터 세포사멸이 촉진 된다는 것을 확인 할 수 있었으며, 동시에 설파살라진이 활성화된 자가포식을 억제하는 결과를 얻었다. 뿐만 아니라, LC3B shRNA 형질주입 된 망막색소상피세포에서는 타목시펜을 노출시키자 컨트롤 벡터가 형질주입 된 세포에 비해 세포 생존률이 현저히 증가하였으며, 설파살라진에 의해 세포 생존률이 더 회복됨을 확인 하였다. 타목시펜에 의한 자가포식 활성에서 활성 산소 종(ROS)가 증가하게 되고, 설파살라진이 증가된 활성 산소 종을 감소 시킴으로써 세포 사멸을 억제하였다. 마지막으로 망막색소상피세포에서 타목시펜에 의한 노인성 황반변성 마커들은 모두 증가하였고, 설파살라진이 증가된 마커들의 발현을 감소시킨 결과를 얻을 수 있었다. 위의 결과들은 타목시펜으로부터 유도되는 망막색소상피세포의 사멸을 설파살라진이 억제 한다는 것을 보여준다. 따라서, 본 연구에서 산화 스트레스, 소포체 스트레스, 타목시펜을 통해 망막색소상피세포의 사멸을 유도하고, 이 과정 중에 관여하는 신호 분자 메커니즘에 대해 처음으로 규명하였다. 위의 연구는 망막색소상피세포의 기능 장애와 사멸의 원인이 되는 노인성 황반변성을 포함하는 망막 질환의 예방과 치료목적의 약물 개발에 도움이 될 것으로 생각된다.