마이크로칩 기반의 구상체 형성을 통한 인슐린 생성 세포 (Insulin producing cells) 의 분화효율과 생존률 향상에 관한 연구

Abstract

Transplantation of pancreatic islet is widely known as the ideal therapy for diabetes patients. Although the experiences with islet transplantation for diabetic control have markedly improved, there still exist several obstacles that may hinder successful clinical applications. Among those obstacles, the shortage of donor, the low engraftment efficacy, and requirement of extensive immune suppression are the main limitations of this approach. In order to find out viable solutions, a number of studies have been reported to make insulin-producing cells from stem cells (Insulin-Producing Cells: IPCs). However, most of the differentiated IPCs do not function enough to replace islets; there are the problems of insufficient secretion of insulin or no glucose stimulated insulin secretion. In this study, the following techniques were used to improve the differentiation efficiency of IPCs : 1) Use of liver cells sharing a common developmental origin with pancreatic cells and free from safety risk of stem cells; 2) Direct trans-differentiation using adenovirus vectors carrying the human PDX-1, NeuoD and MafA genes, all of which are important transcription factors in the pancreatic developmental stage; and 3) Enhancement of differentiation efficacy using 3-dimensional (3D) spheroid formation based on BioMEMS technology. 3D IPC spheroids were prepared using microchip with 853 micro-concave well (diameter 400 μm) in the 1cm*1cm mold. It was confirmed that the size of the spheroid was increased (R2 = 0.998) in proportion to the number of cells by transplanting the liver cells and IPCs from 2*105 cells to 2*106 cells. The diameter of the spheroid seeded with 106 cells was between 150 and 200μm (diameter of liver cell spheroid: 152.7 ± 13.5 μm, the diameter of IPC spheroids: 175.8 ± 18.0μm). Based on previous studies, the ideal diameter of pancreas islet was about 150 μm. Based on these results, it was possible to mass-produce spheroids of the desired size with the use of concave microwell. The expression of transcription factors (PDX1, NeuroD, and MafA) was introduced to liver cells for differentiation and was confirmed by immunocytochemistry in 3D spheroid. Gene expression of transcription factors related with beta cell differentiation (PDX1, NeuroD, MafA, NKX6.1, NGN3, and FOXA2), and pancreatic endocrine hormone (insulin, glucagon, somatostatin) were evaluated to compare the differentiation efficacy of IPCs cultured in two-dimensional (2D) culture dish or in 3D spheroid. Compared with 2D culture, insulin gene expression was increased more than three-fold in 3D spheroid and glucose was decreased ten-fold. In addition, the expression of E-cadherin genes was increased in spheroid. Based on the results of previous studies, it was shown that the increase of cell-to-cell interaction leads to the increase of insulin secretion and the differentiation of pancreatic islets. Insulin protein expression was confirmed by immunohistochemistry and ELISA, and insulin production was increased in IPC spheroids. Diabetes was induced by administering 180 mg/kg streptozotocin to immunodeficient mice (Nude mice) to evaluate the blood glucose control of IPCs. As the control group, the IPCs cultured on 2D culture dish was put into preparation. IPCs and IPC spheroid with 2x106 cells were transplanted into the kidney capsule in the diabetic nude mouse. The blood glucose and body weight was evaluated for 4 weeks after transplantation. Blood glucose level of IPC spheroid group was decreased to 200 mg/dl after transplantation, but it gradually increased during 4 weeks. However, in the mouse with single IPC transplants, blood glucose showed the tendency of an increase for 4 weeks without any decrease of blood glucose. Mouse transplanted with IPCs and IPC spheroid maintained the body weight for 4 weeks but weight loss was induced in the diabetic control. At the 3rd and the 14th days after transplantation of IPCs, the kidney was harvested to confirm the transplanted cells by immunohistochemistry. As for the mouse transplanted with IPCs or IPC spheroid, PDX1 expressing cells were stained to confirm that the transplanted cells survived after 3 and 14 days of transplantation respectively, and it was confirmed that some of these cells produced insulin. We also confirmed cell survival using in vivo cell tracking imaging system. With such results, that mass production of 3-dimensional spheroids with a designed shape and size of IPCs using micro-concave well was confirmed. Moreover, 3D spheroid formation enhanced differentiation efficacy of IPCs in vitro and the function of glucose control in vivo. |췌장도세포 이식은 인슐린 의존성 당뇨의 근본적인 치료법이다. 하지만 공급원 부족, 이식 후 낮은 생존률, 면역억제제 사용의 문제로 인하여 임상적 적용의 한계를 갖고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 자가 세포 분화를 통하여 인슐린 생성세포 (Insulin producing cell)를 만들어 이식하려는 많은 연구가 진행되고 있다. 하지만 현재까지 개발된 대부분의 분화 세포는 인슐린 분비가 잘 되지 않거나, 글루코즈에 낮은 반응성을 갖고 있다. 본 연구에서는 다음과 같은 기술을 이용하여 인슐린 생성세포의 분화효율을 높이고자 하였고, 개발된 인슐린 생성세포 및 구상체를 이용하여 체내·외 평가를 수행하였다. 1) 췌장조직과 기원이 같은 간 유래 세포의 사용, 2) 췌장발생에 중요한 전사인자인, PDX1, NeuroD, MafA 를 아데노바이러스를 이용하여 세포내 전달하여 직접 분화 유도, 3) BioMEMS 기술 기반의 micro-concave well 을 이용한 3차원 구상체 배양 등의 방법을 사용하였다. 3차원 인슐린 생성세포 구상체는 하나당 853개의 micro-concave (지름 400μm) 를 갖고 있는 칩을 이용하였다. 간세포 및 인슐린 생성세포를 2x105 부터 2x106 세포를 이식하여 세포수에 비례하여 구상체의 크기가 증가함을 확인하였다 (R2=0.998). 106 세포를 사용하여 제작된 구상체는 지름이 150~200 μm 사이의 크기를 갖고 (간세포 구상체 지름: 152.7 ± 13.5μm, 인슐린 생성세포 구상체 지름:175.8 ± 18.0 μm) 약 10% 표준편차를 보여서, 기존의 연구에서 보고된 이상적인 췌장도세포와 가장 유사한 크기와 형태를 갖고 있었다. 이러한 마이크로칩을 이용한 구상체 형성은 많은 수의 3차원 구상체를 일정한 형태 및 크기를 갖고 대량으로 생산할 수 있었다. 분화유도를 위하여 도입된 전사인자 (PDX1, NeuroD, MafA)가 대부분의 세포에서 발현되는 것을 면역염색(Immunocytochemistry)을 이용하여 확인하였고, 3차원 구상체를 형성하였을 때도 도입 유전자의 발현이 유지되고 있음을 확인하였다. 세포배양접시를 이용한 일반적인 2차원 배양방법과, 3차원 구상체 형성방법의 분화능 평가를 위하여 췌장 내분비 호르몬 (insulin, glucagon, somatostatin) 과 pancreatic β cell 관련 전사인자 (PDX1, NeuroD, MafA, NKX6.1, NGN3, FOXA2) 의 유전자 발현을 비교하였다. 2차원 배양에 비하여 3차원 구상체에서 insulin 유전자 발현은 3배이상 증가하였고, glucose 는 10배 이하로 감소하였으며, 이는 구상체 형성으로 인하여 인슐린 생성세포로의 선택적 분화능이 향상됨을 알 수 있었다. 또한 구상체에서 E-cadherin과 M-cadherin 같은 세포 결합력 증가에 관한 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 세포간의 결합력 증가는 인슐린 분비능 증가 및 분화를 유도하는 것으로 보고되어 있다. 인슐린 단백질 발현은 면역염색 및 ELISA 방법을 통하여 확인하였으며, 3차원 구상체에서 인슐린 생성이 증가함을 확인하였다. 혈당 조절능을 평가하기 위하여 면역결핍 마우스 (Nude mouse)에 180mg/kg streptozotocin을 투여하여 당뇨를 유도하였다. 인슐린생성세포 삼차원 구상체를 실험군으로 하였고, 대조군으로 2차원에서 배양한 인슐린 분비세포를 같은 수로 신장 피막에 이식하였다. 이식 후 4주간 체내 혈당 조절능을 평가하였다. 3차원 인슐린 생성세포를 이식한 경우 이식 직후 200mg/dl 로 혈당 감소 후 유지되는 경향을 보였다. 반면에 2차원 배양으로 분화 시킨 후 단일세포로 이식한 경우 4주간 꾸준히 혈당이 증가하여, 4주후 600mg/dl 까지 증가하였으며, 약간의 체중 감소가 나타났다. 인슐린 생성세포 이식 3, 14 일 후 신장을 적출하여 조직 내 세포의 생존 및 insulin 분비세포를 확인하였다. 인슐린생성세포 구상체를 이식한 경우 이식 14일 이후에도 이식된 세포가 생존하고 있음을 PDX1 유전자 발현세포를 염색하여 확인하였으며, 이러한 세포 중 일부가 insulin 을 생성하고 있음을 확인하였다. 단일 세포를 이식한 경우에는 이식 직후에는 세포를 확인할 수 있었으나, 일주일 이후 대부분의 세포가 소실되었다. 본 연구에서는 이러한 결과를 바탕으로 concave microwell 을 이용하여 인슐린 생성세포의 일정한 형태와 크기의 3차원 구상체의 대량 생산이 가능함을 확인하였고, 체외 분화능 평가 및 체내 혈당조절능이 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 인슐린 생성세포 3차원 구상체는 인슐린 의존성 당뇨환자에게 유용한 치료법이 될 수 있다.