소포체 스트레스가 유도된 간 조직에서 Autophagy 유전자 발현 관찰과 소포체 스트레스에서 ATF4 의존적 TFEB 핵 이동 연구

Abstract

진핵세포에서 소포체 기능이상은 소포체 스트레스를 유발한다. 이때 세포는 UPR (unfolded protein response)이라 칭하는 반응을 통해 소포체 기능을 보호한다. UPR은 소포체 스트레스가 지속되는 동안 소포체에 축적된 미성숙 단백질(unfolded proteins)을 제거하기 위하여 proteasome과 autophagy같은 단백질분해 시스템과 함께 작용한다. 그러나 소포체 스트레스가 오래 지속되면 세포는 아폽토시스(apoptosis)를 통해 죽게 된다. 따라서 autophagy의 활성 조절은 세포 생존에 영향을 줄 수 있다. 본 연구는 소포체 스트레스에 의한 autophagy의 변화를 조직 수준에서 확인함으로서, 소포체 스트레스에 노출된 동물의 생존 변화의 원인을 알아보기 위한 실험이다. 소포체 스트레스를 조직 수준에서 관찰하기 위해 정상 쥐 C57BL/6를 사용한 in vivo 실험을 하였다. 소포체 스트레스를 유발하기 위해 강력한 당화억제제인 Tunicamycin(Tm)을 주사한 후 20일 동안 관찰을 하였다. 소포체 스트레스를 유발하고 5일째에 마우스 survival이 급격히 감소하였기 때문에 5 day를 기준으로 UPR과 autophagy 변화를 확인하였다. 결과 5 day에 마우스 survival이 크게 감소한 것에 비해 UPR은 이미 회복 단계에 들어간 것을 확인하였고 이는 UPR의 활성화와 생존변화에는 연결점이 약하다는 것을 확인하였다. 반면 autophagy 활성은 5 day에 큰 변화를 나타냈다. Autophagosome marker인 LC3B-Ⅱ와 오토파지 기질인 p62의 높은 축적을 보였고 이에 비해 Lysosome 기능에 관여하는 LAMP1, 2의 감소와 Lysosome 단백질 분해효소인 Cathepsin들의 성숙이 크게 억제되었으며, Autophagosome과 Lysosome의 융합에 관여하는 Vamp8의 큰 감소가 확인되었다. 또한 lysosome biogenesis에 관련된 유전자들의 발현에 관여하는 중요한 전사인자로 알려진 TFEB(Transcription Factor EB)의 발현도 감소한 것이 확인되었다. 본 연구를 통하여 간 조직 수준에서의 소포체 스트레스에 대한 Autophagy 기능의 감소경향성만 확인되었을 뿐 이런 현상이 동물생존과 관계가 있는지는 아직 확인되지 않았기 때문에 TFEB의 과 발현 또는 Autophagy 기능 회복 등이 동물생존과 관계가 있는지 확인하기 위한 추가적인 실험이 필요하다.|진핵세포에서 소포체 기능이상은 소포체 스트레스를 유발하고 이는 UPR (unfolded protein response)이라 칭하는 반응을 통해 소포체 기능을 보호한다. UPR은 소포체 스트레스가 지속되는 동안 소포체에 축적된 미성숙 단백질(unfolded proteins)을 제거하기 위하여 autophagy같은 단백질분해 시스템과 함께 작용한다. UPR의 PERK pathway에 속하는 ATF4는 autophagy를 조절하는데 필요한 전사인자라는 것은 알려져 있다. 그러나 오토파지 유전자들의 발현에 관여하는 중요한 전사인자로 알려진 TFEB의 핵 이동에 대한 연구는 확인되지 않았다. 본 실험은 ATF4가 TFEB를 통한 autophagy 조절에 어떤 관계가 있는지를 알아본 실험이다. 실험을 위해 정상 세포와 ATF4가 결핍된 세포에서 소포체 스트레스에 대한 UPR과 autophagy 변화를 비교하였다. 소포체 스트레스를 유발하기 위해 강력한 당화억제물질인 Tunicamycin(Tm)을 사용하였다. 면역형과요법(Immunofluorescence) 분석으로 소포체 스트레스가 유발되었을 때 TFEB와 TFE3의 핵 이동을 확인하였고, 결과 ATF4가 결핍된 간세포에서 핵 이동이 부분적으로 저해된다는 것을 확인하였다. 단백질과 mRNA 분석은 ATF4 의존적 유전자들의 발현이 감소한 ATF4 결핍 세포의 경우, UPR 유전자 발현이 상대적으로 약화된 것을 확인하였다. Autophagy 유전자 발현의 경우 autophagosome marker인 LC3B의 차이는 없었으나, 각각 오토파지 시작과 오토파지 phagopore 형성에 관여하는 Beclin1의 발현 및 ATG5-ATG12 conjugation이 감소하였고 cargo receptor인 p62의 감소 등 전반적으로 autophagosome 형성에 문제가 생겼음을 확인하였다.Lysosome의 경우는 TFEB/3에 의해 발현이 조절되는 LAMP1, 2의 감소와 Lysosome 단백질 분해효소인 Cathepsin들의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 즉 ATF4 결핍은 autophagosome 형성을 저해시키고, TFEB의 핵 이동을 저해함으로서 lysosomal biogenesis를 저해시킴을 예상할 수 있다. 이를 확실하게 증명하기 위해 autophagosome의 형성이 확실히 감소하였는지, 또한 autophagy process 중 fusion에는 문제가 없는지 확인할 필요가 있으며, ATF4 결핍 세포에 ATF4를 회복시켜주었을 때 autophagy 활성 저하가 회복되는지 확인할 필요가 있다.