약물에 의해 유도된 인지질증 예측을 위한 사람 간 유래 3D 오가노이드의 유용성

Abstract

Drug-induced phospholipidosis (PL) is a phospholipid storage disorder caused by the formation of phospholipid-drug complexes in lysosomes. PL caused by the drug in human can be a problem in the pharmaceutical development. It is not certain that PL in an animal is toxicologically relevant to human due to the metabolic differences between species. To screen out compound with potential inducing PL in human, cell-based in vitro assays using various types of cells from human origin have been reported. We established three-dimensional (3D) human liver organoid according to the method as described previously (Broutier et al., 2016). Drug-induced PL has been testified in 3D human liver organoid and HepG2 cells cultured by the conventional method by systemically examining cellular alterations including viability change, albumin content, microscopic examination with special immunostaining and transmission electron microscope and gene expression change specialized to PL. As a result of various evaluation about characteristics of the organoids and HepG2, organoids that underwent differentiation to hepatocytes showed more similar nature of hepatocyte than HepG2 cells. 3D human liver organoids survived in high dose PL-inducing drug rather than HepG2 cells for 48 h of drug incubation. 3D liver organoids kept the capacity of albumin secretion more stable than monolayered HepG2 cells. In the morphological evaluation of PL, the more potent PL-inducing drug administrated, the more cytoplasmic vacuoles were observed in organoids and HepG2 cells, and to a greater extent in organoids. In immunohistochemistry of lysosome-associated membrane protein 2 (LAMP-2), a special marker for lysosome membranes, the expression of LAMP-2 in organoids seemed more apparent than that in HepG2 cells in the same condition. PL-characteristic lamellar bodies were observed in only in the amiodarone-treated organoids under the transmission electron microscopic examination. Our present study showed that 3D cultured human liver organoids were more sensitive to drug-induced PL and less affected by cell death toxicity than HepG2 grown in a monolayer. Since PL is chronic cellular alteration rather than cytotoxic acute toxicity, these results support well that 3D cultured organoids reflected the metabolite-mediated hepatotoxicity in vivo. Conclusively, 3D human liver organoids appeared to be a relevant system for evaluating phospholipidogenic effects of compounds. As cell-based approaches, 3D human liver organoids can be used early in the drug development process to identify chemicals with the potential to induce PL.|약물에 의해 유도되는 인지질증은 세포 내 리소좀(lysosome)에 인지질-약물 복합체가 형성되어 축적되는 일종의 저장장애이다. 인지질증은 신약개발 과정의 전임상 시험에서 세포질 공포와 같은 형태로 빈번하게 관찰되는 결과이지만, 인지질분해효소 등의 종간 차이 때문에 동물실험에서 관찰된 변화가 사람에서 동일하게 재현되는지 예측하는 것은 어렵다. 따라서 약물이 사람에서 인지질증을 유도하는지 선별하기 위해 사람 유래 간암세포주나 일차(primary) 세포를 이용한 다양한 세포 기반 실험이 보고되고 있다. 오가노이드(organoid)는 사람 성체 조직 유래 세포를 시험관 내 환경에서 팽창시킬 수 있는 3차원 형태의 독특한 세포 배양 시스템이다. 본 연구에서는 Broutier 등 (2016)의 방법에 따라 사람 간 조직 유래 오가노이드를 구축하였고, 오가노이드가 갖는 간세포 특성을 확인한 후 사람에서 인지질증을 유발한다고 알려진 약물을 처리하여 나타나는 변화를 기존의 2차원 형태로 배양된 사람 유래 간암세포주(HepG2)와 비교하였다. 인지질증을 유발하는 약물로는 유발 강도가 다른 amikacin, amiodarone, sertraline을 선정하였고 인지질증 음성 대조군 약물로 acetaminophen을 사용하였다. 약물들을 5 μM 또는 10 μM 농도로 48시간 동안 세포에 처리한 후 오가노이드와 HepG2 세포의 생존성, 알부민 분비량 변화를 분석하고, 형태학적 변화. 조직면역화학염색을 통한 LAMP-2 발현 및 약물에 의한 유전자 발현 변화를 통해 인지질증의 유발을 확인하였고 투과전자현미경 검사를 통해 확진하였다. 오가노이드에서의 CYP3A4 유전자 발현, HNF4α 발현 정도가 HepG2 세포보다 높게 나타났고 오가노이드가 글리코겐을 축적할 수 있다는 것을 확인하였다. 약물에 의한 생존성과 알부민 분비량은 동일 약물, 동일 농도 처리군을 비교하였을 때 오가노이드가 HepG2 세포보다 덜 민감하게 변화하였다. 인지질증 유발 정도는 같은 세기의 약물 처리 시 오가노이드가 HepG2 세포보다 더 민감하게 반응하였고 HepG2 세포는 강력한 인지질증 유발 약물에서는 세포가 사멸하였다. 사람 간 오가노이드는 간암 유래 세포주인 HepG2 세포보다 사람 정상 간세포와 더 유사한 특성을 나타냈고, 3차원 형태로 배양된 사람 간 오가노이드는 인지질증에 의한 독성 변화와 관련하여 기존의 방식으로 2차원적으로 배양된 HepG2 세포보다 생체 내 환경을 더 반영하는 것으로 생각된다. 결론적으로, 사람 간 오가노이드는 사람에서 약물에 의한 인지질증을 평가하는 데 유용하게 쓰일 수 있다.