아민 기능화 된 규조토를 이용한 병원균 진단을 위한 단일 튜브 방법

Abstract

Simple and efficient sample preparation is desirable for point-of-care testing of emerging diseases such as zoonoses, but current sample preparation assays are insensitive, labour-intensive and time-consuming and require multiple instruments. In this study, we developed an amine-functionalized, diatomaceous earth (DE)-based, homobifunctional imidoesters (HI) reagents assisted single-tube extraction system as a novel binding strategy to improve the solid phase extraction (SPE) method for rapid and simple purification of nucleic acid from biological samples including human cells and pathogens. A complex of amine-modified DE and HI reagents were used for nucleic acid extraction from the zoonotic pathogen, Brucella ovis. Using our single-tube approach, the pathogenic nucleic acid can be extracted within 20 min at a level of 1 colony formation unit (CFU). This single-tube system is based on reversible cross-linking reactions between nucleic acid and the silica matrix. The formation of robust covalent bonds protects nucleic acid, especially RNA, from both the difficulty of washing steps and isolation with ribonuclease (RNase)-rich samples leading to the extraction of higher quality nucleic acid. The performance of this approach is 10–100 times better than that of a commercial kit (10^2 to 10^3 CFU mL^-1) but does not require a large centrifuge. Compared to standard solid phase extraction based commercial kits, our single-tube system can be efficiently isolate pathogenic nucleic acid in human urine and serum, and the detection limit is enhanced by up to 100 times (1 CFU mL^-1 in urine and serum). This system is fast and highly sensitive and thus represents a promising approach for sample preparation in the point-of-care testing.|동물원성 감염병과 같은 신생 질병에 대한 현장 진단 검사에는 간단하고 효율적인 시료 준비가 바람직하지만, 현재 시료 준비 및 분석은 민감하지 않고, 노동 집약적이며, 시간 소모적이며, 여러 장비가 필요하다. 본 연구에서는 고체상 추출 (solid phase extraction, SPE) 방법을 개선하기 위한 새로운 결합 방법으로 아민 기능화 된 규조토와 동형2기능성 이미도에스터 (Homobifunctional imidoester, HI)를 사용하여 신속하고 간단하게 병원균 및 세포를 포함하는 생물학적 시료에서 핵산을 추출하는 단일 튜브 시료 준비 방법을 개발하였다. 아민 기능화 된 규조토와 HI의 복합체가 인수공통 병원균인 Brucella ovis으로부터의 핵산 추출에 사용되었다. 단일 튜브 접근 방식을 사용하면 20분 내로 튜브 내의 1 집락 형성 단위 (Colony forming unit, CFU)의 수준까지의 병원균의 핵산을 추출할 수 있다. 이 단일 튜브 방식은 핵산과 규토 기질 사이의 가역적인 교차 결합 반응 (reversible cross-linking reaction)을 기반으로 작용한다. 활발한 공유 결합의 형성은 핵산, 특히 RNA를 리보핵산 가수분해 효소 (ribonuclease, RNase)가 풍부한 시료로부터 보호하여 핵산의 세척과 분리 단계의 어려움을 해결해 준다. 이 방법의 성능은 상업용 키트 (10^2-10^3 CFU mL^-1)보다 10-100 배 우수하지만, 대형 원심 분리기 등의 복잡한 장비가 필요하지 않다. 일반적인 SPE 키트에 비해 단일 튜브 시스템은 인간의 소변과 혈청에서 병원균의 핵산을 효율적으로 분리할 수 있으며 검출 한계가 최대 100 배까지 향상된다 (소변, 혈청 내에서 1 CFU mL^-1). 이 시스템은 빠르고 민감하기 때문에 현장 진단 검사에서 시료 준비를 위한 유망한 접근법을 제시한다.