세포의 장기 계대 배양이 장 흡수 모델 Caco-2 세포의 integrity와 에너지 대사에 미치는 영향

Abstract

Intestinal absorption is an important property to determine bioavailability of oral drugs and a monolayer of human small intestinal epithelial cells differentiated from Caco-2 cell (human colon adenocarcinoma) is the most ideal in vitro assay for screening intestinal absorption of orally administered compounds during drug discovery. However, which passage number of Caco-2 should be used has not been standardized yet, even though drug efflux has been reported to be increased in late-passage cells like cancer cells. In this study, we evaluated drug efflux and energy metabolism in each early- and late-passage monolayers to check if over-passaging turns the monolayer of normal enterocytes into a cancer-like monolayer. Transepithelial electrical resistance (TEER) across the monolayer was higher in late-passage monolayers than in early-passage monolayers, which indicated that the tightness of the tight junctions in the late-passage monolayers was increased. Additionally, a higher gene expression of P-glycoprotein (P-gp), an efflux protein, was observed in late-passage monolayers. Consistently, the efflux ratio of P-gp substrates (digoxin, quinidine and saquinavir) in the late-passage monolayers were markedly higher than those of early-passage monolayers, whereas transcellularly or paracellularly transported drugs (metoprolol or atenolol) were equally permeated. LC-MS/MS analysis of tricarboxylic acid (TCA) cycle revealed the decreased metabolite pool size in glutamate, glutamine, lactate, serine and succinate in late-passage monolayers. Our study compared Caco-2 monolayers of different passages using a metabolomics approach and we conclude that late-passage Caco-2 monolayers are recommended for a better prediction of intestinal absorption of drugs designed to work in cancerous environments. |장 흡수는 경구 약물의 생체 이용률을 결정하는 중요한 속성이며, 분화 시 사람의 소장 상피 세포와 흡사해지는 Caco-2로 이루어진 단층 시스템은 경구로 투여되는 화합물의 장 흡수를 스크리닝 하기 위한 가장 이상적인 in vitro 시험 방법이다. 이런 Caco-2 세포는 계대 수가 증가할수록 약물의 저항성이 높아진다는 것이 알려져 있음에도 불구하고, Caco-2 세포를 이용한 시험에 어떤 계대 수의 세포를 사용해야 하는지는 아직 표준화되지 않은 상태이다. Caco-2 세포는 암세포 유래이지만 분화 시 정상 소장 상피 세포와 흡사해지는데, 과연 세포의 장기 계대 배양이 Caco-2 세포를 암화 된 소장 상피 세포로 분화시키는지 알아보기 위해 계대 수가 높은 Caco-2 세포로 이루어진 소장 상피 세포 단층의 약물 efflux 정도와 에너지 대사를 평가했다. 계대 수가 높은 Caco-2 단층에서 내피 전기 저항 (TEER) 이 계대 수가 낮은 세포의 단층보다 높게 나왔고, 이를 통해 계대 수가 높아지면 세포의 단층이 더 단단해진다는 것을 알 수 있었다. 또한, 계대 수가 높은 세포 단층에서 efflux protein인 P-glycoprotein (P-gp)의 단백질 발현이 높아져 있었고, 이에 따라 P-gp 물질들의 efflux 정도가 계대 수가 높은 Caco-2 단층에서 높아져 있었다. 세포 단층의 에너지 대사 분석을 위해 LC-MS/MS를 이용하였고, 분석 결과, glutamate, glutamine, lactate, serine 그리고 succinate의 대사체 pool size가 계대 수가 높은 Caco-2 단층에서 낮아져 있는 것을 확인하였다. 이번 연구에서 낮은 계대 수와 높은 계대 수의 Caco-2로 이루어져 있는 소장 상피 세포 단층의 비교 연구를 대사체 분석 측면에서도 진행하였고, 이를 통해 암화 된 상태에서의 약물 흡수를 보다 더 정확하게 예측하기 위해서는 계대 수가 높은 Caco-2를 이용해야 한다는 것을 알 수 있었다.