새로운 질병 진단법 개발을 위한 주사기 필터를 이용한 병원체 핵산 분리 기술 및 정확한 검출 기술 연구

Abstract

박테리아와 바이러스에 의한 감염병은 전 세계적으로 많은 사람들에게 위험을 주며, 심각할 경우에는 경제적 손실을 포함한 문제를 일으킬 수 있습니다. 최근 중증급성호흡기증후군(SARS-CoV-2)로 인한 코로나바이러스(COVID-19) 대유행은 빠르게 확산되어 전 세계의 의료 시스템과 경제적인 커뮤니티에 심각한 영향을 주었습니다. 따라서 감염병의 추가적인 확산을 방지하고 의료시설 및 진단시설의 부담을 줄여주며 빠른 치료를 보장하기 위해서는 감염병에 대한 정확하고 신속하며 진단이 매우 중요합니다. 질병의 빠르면서 정확한 분자 진단을 위한 다양한 기술의 개발되고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 몇 가지 해결해야 하는 단점은 계속 존재하고 있습니다. 예를 들어, 병원균의 농도가 매우 낮은 임상 샘플과 복잡한 과정을 필요로 하는 기구들, 시간이 많이 걸리며 전문적인 인력을 필요로 한다는 문제점이 아직까지 있습니다. 이러한 문제점들은 해결하기 위해서 PVDF 주사기 필터를 사용하여 병원체 농축과 핵산 추출을 할 수 있는 새로운 방법과 임상 검체에서 정확한 검출을 수행하는 데 사용할 수 있는 민감한 검출 기술들을 이용한 새로운 질병 진단 분석을 개발했습니다. 검체 전처리 단계를 위해, 우리는 환자에게서 채취한 시료에서 박테리아나 바이러스를 농축 및 핵산 추출을 위해 상용화된 제품인 PVDF 주사기 필터를 이용한 방법을 개발했습니다. PVDF 주사기 필터에, DMP라는 가교결합 역할을 해주는 HI 시약 중 하나의 물질을 사용하였습니다. DMP는 핵산의 아민 그룹과 반응하여 아미딘 결합을 형성하고 정전 결합을 생성하는 두 개의 이미디에스테르 그룹으로 구성됩니다. PVDF 막의 표면에 병원체가 붙잡히면 병원체의 세포를 용해하여 핵산을 추출했습니다. 이 DMP와 PVDF 주사기 필터를 이용한 샘플 전처리 플랫폼은 정교한 기기를 사용하지 않고 손으로 조작할 수 있으며, 30분 이내에 가능합니다. 이런 방법은 지금의 상용하고 있는 추출 제품을 사용하여 추출한 경우와 비교했을 때 이에 필적할 만한 효율을 보여줍니다. 검출을 위한 방법으로 육안으로 바로 확인이 가능한 등온증폭을 이용한 핵산 검출 방법을 개발했습니다. SARS-CoV-2 진단을 위해 등온성 증폭 방법 중 RPA, HDA, LAMP을 사용했습니다. 3가지의 등온성 증폭 방법 중 LAMP에서 가장 좋은 효율을 보여주었습니다. 여기에 LFA 또는 colorimetric 방법을 사용하면 육안으로 결과를 바로 확인할 수 있습니다. 이러한 방법들을 이용하여 우리는 COVID-19 검출을 위해 23개의 임상 검체에서 이 방법의 가능성을 입증했습니다. 다음으로, 포인트 돌연변이의 검출은 분자 표적화, 맞춤형 약물 전달, 치료 진행 및 종양의 약물 저항성 모니터링에 큰 이점을 가지고 있습니다. 기존 돌연변이 검출 기술은 비용이 많이 들고 복잡하며 대립 유전자에 특화되어 있거나 한 번에 다중 탐지를 허용하지 않습니다. 그래서, 우리는 새로운 기법으로 hot spot-specific probe (HSSP)를 이용하여 대장암(CRC) 환자의 조직 샘플에서 KRAS 돌연변이를 검출하는 기법을 개발했습니다. 추가적인 단계 없이 높은 감도와 빠른 속도, 간단한 분석 방법으로 돌연변이를 검출할 수 있습니다. 본 연구에서 제안된 샘플 준비 기법은 소량 또는 많은 양의 임상 샘플과 함께 사용할 수 있는 간단하고, 신뢰할 수 있는 민감도를 가지는 저렴한 플랫폼을 제공하므로 다양한 감염성 질병에 대한 엄청난 유용성을 가지고 있습니다. 또한, 육안으로 확인이 가능 한 등온성 증폭법을 이용한 검출 기술 및 HSSP를 사용하는 검출 기법은 이러한 팬데믹 시대에 의료진의 부담을 줄이기 위한 사전 선별 플랫폼으로 가정 및 클리닉에서 COVID-19 같은 감염성 질병 혹은 암과 같은 질병에 대한 간단하고 편리하며 효율적이며 저렴한 진단 분석을 제공합니다. 함께, 제안된 기술(샘플 준비 및 검출기법)의 통합은 임상 응용 분야에서 기존 방법보다 빠르고 저렴한 진단 분석을 제공할 수 있습니다. |Infectious Diseases caused by bacteria and viruses can lead to major problems, including economic loss and death. Recently, the coronavirus disease (COVID-19) pandemic caused by the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV)-2 spread rapidly and severely limited the capabilities of public health communities and systems around the world. Therefore, accurate, rapid, and robust diagnostic tests for infectious diseases are crucial to prevent the further spread of the infection, alleviate the burden on healthcare and diagnostic facilities, and ensure timely therapeutic intervention. Despite the development of various techniques for the rapid and accurate molecular diagnosis of disease, several challenges for diagnosis continue; for example, numerous clinical samples with low concentrations of pathogens, and large instruments, complex manuals, are time-consuming. The problems must be addressed. In this study, we developed a novel disease diagnosis assay using polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filter and sensitive detection techniques that can be used to perform pathogen enrichment, nucleic extraction and accurate detection in clinical specimens. For the sample preparation step, we developed a commercial hydrophilic PVDF syringe filter to test the collected spiked bacteria and biopsy samples from patients. Because of the pore of membranes and cross-linking reagents like dimethyl pimelimidate (DMP), pathogens were collected at the surfaces of membranes. After the cell lysis step, we extracted nucleic acids. DMP consists of two imidoester groups that react with amine groups of nucleic acids to form amidine bonds and generate electrostatic coupling. This self-powered sample preparation platform can be operated by hand, without the use of any sophisticated instrumentation, and is possible within 30 minutes. Compared to the case extracted with commercial kits, it shows comparable efficiency for the sample preparation. For the detection step, we developed the detection method of nucleic acids using isothermal amplification with the naked-eye. We used the recombinase polymerase amplification (RPA), Helicase-dependent amplification (HDA) and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as isothermal nucleic acid amplification methods to test SARS-CoV-2 diagnosis. The naked-eye assay with the lateral flow method or colorimetric method was delivered result immediately. The limit of detection using the proposed techniques was higher sensitive than that of the end-point PCR. We validated the accuracy of the system by using 23 clinical nasopharyngeal specimens for COVID-19 detection. Next, the detection of single point mutation is of great significance in the early diagnosis of cancers, molecular targeted, customized drug delivery guidance, treatment progression, and monitoring of tumor's drug resistance. Existing mutation detection techniques are expensive, complex, allele-specific, or does not allow for multiplex detection at once. Thus, we developed a hot spot-specific probe (HSSP) for the detection of KRAS mutation from tissue samples of colorectal cancer (CRC) patients. Without any additional steps, we can detect the mutation with high sensitivity and rapidity by quantitative real-time PCR. The proposed sample preparation technique in this study provides a simple, reliable, cost-effective, and sensitive platform for use with small to large volumes of clinical samples and thus has tremendous utility for various infectious diseases. In addition, the isothermal amplification methods with the naked eye and HSSP platform offer simple, facile, efficient, and inexpensive diagnosis assays of infectious diseases like COVID-19 and Cancers at home and the clinic as a pre-screening platform to reduce the burden on the medical staff in this pandemic era. Taken together, the integration of the proposed techniques (sample preparation and detection) could be provided a faster and cheaper diagnostic assay than the existing method in clinical applications.