Topoisomerase IIα와 상호작용하는 Liver X Receptor β subdomain 확인 및 기능 분석

Abstract

핵수용체 Liver X Receptor (LXR)의 두 isoform인 LXRα (NR1H3)와 LXRβ (NR1H2)는 높은 homology를 가지고 있으나, knockout mouse의 표현형에 있어 분명한 차이를 가지고 있다. 그러나, 전사인자로서의 LXRα와 LXRβ의 활성에 있어서 이 둘 간의 차이점에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 흥미롭게도, 선행연구에서 human DNA topoisomerase IIα (hTOP2Α)가 LXRα와 interaction하지 않고, LXRβ와는 specific한 protein-protein interaction을 통해 LXRβ의 coactivator로 작용하는 것을 밝혀냈다. 본 연구에서는 높은 homology를 보이는 두 isoform 중 LXRβ만 TOP2A와 interaction을 할 수 있는 능력을 부여하는 LXRβ 부위를 규명함으로써, TOP2Α의 LXRβ-specific activation mechanism을 설명하고자 하였다. 먼저, LXR 전체를 DNA binding domain (LXRβ-DBD), hinge-Ligand binding domain (LXRβ-hinge-LBD), Helix 12 (H12)가 제거된 나머지 부분(LXRβ-ΔH12)의 세 부분으로 나누어 GST-fusion 단백질을 제작하였다. 제작한 단백질을 이용해 GST pull down assay를 시행하여 TOP2A가 LXRβ hinge-LBD와 interaction이 가장 강하게 나타나는 것을 확인했다. LXRβ hinge-LBD의 TOP2A interaction domain을 구체적으로 mapping하기 위해 secondary structure를 기준으로 LXRβ hinge-LBD를 다시 7개의 작은 fragment construct로 제작하였다. 이를 이용하여 TOP2A와 GST pull down assay를 진행한 결과, LXRβ의 hinge domain 부분이 포함된 fragment에서 가장 강한 interaction을 보였고, 이것을 근거로 LXRβ의 hinge부분에 주목하였다. 이 LXRβ hinge domain이 TOP2A와의 interaction에 있어 실제 기능을 가지고 있는지 확인하기 위해, LXRβ의 hinge를 LXRα hinge로 바꾼 hybrid construct인 LXRβ_αH를 제작하였다. 이 LXRβ_αH를 이용하여 각각 ABCA1, ABCG1, SREBP1c promoter에서 전사활성에 미치는 TOP2A의 영향을 luciferase assay를 통해 비교 분석하였다. 그 결과 LXRβ_αH에서도 LXRβ와 같이 TOP2A의 coactivator function이 여전히 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 LXRβ hinge domain은 LXRβ 와 TOP2A의 protein-protein interaction에 중요한 역할을 하지만, TOP2A의 LXRβ specific activation을 단독으로 결정하는 부분은 아닌 것으로 생각된다.