다발골수종세포에서 레이저티닙에 의한 세포사 및 신호 기전 연구

Abstract

배경: 다발골수종은 B림프구의 성숙과정 중 마지막 단계인 형질세포의 비정상적인 분화 및 증식으로 인해 발생하는 질환으로, 정상적인 항체 대신 비정상적인 단클론항체인 M단백질을 과도하게 분비하는 것이 특징이다. 대표적인 임상적 증상으로는 고칼슘혈증, 신부전, 빈혈, 뼈 병변 등이 있다. 이 질환은 현재 항암화학요법과 조혈모세포이식으로 치료되고 있지만, 완치가 어렵고 재발위험성이 높다. 레이저티닙 (Lazertinib)은 기존 치료제에 대해 돌연변이가 발생한 비소세포폐암에 사용되는 약물로서 좋은 효능을 가진 약물로 평가되고 있지만, 다발골수종에서의 효과는 아직 알려지지 않았다. 따라서, 본 연구에서 레이저티닙이 다발골수종 세포에 미치는 영향을 알아보고 약물의 효능을 평가하기 위해서 실험을 진행하였다. 방법: 다발골수종 세포주인 RPMI-8226 세포에 레이저티닙을 72시간 동안 처리한 후, CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay를 이용해 세포생존율을 확인하고, BrdU assay를 통해 세포증식률을 확인하였다. Annexin V를 염색하여 세포사의 발생을 확인한 후, 세포자멸사 여부를 보기 위해 caspase 활성도와 Dioc6(3) 염색을 진행하고 유세포 분석기를 통해 분석하였다. Propidium iodide(PI)/RNase 염색으로 세포주기의 변화를 관찰하였고 세포자멸사와 세포주기 관련 단백질들의 발현을 Western blot을 통해 확인하였다. 결과: RPMI-8226세포의 양성 그리고 음성 표지분자를 확인하여 다발골수종 세포주임을 입증하였다. RPMI-8226세포에서 레이저티닙을 처리했을 때, 농도가 높아질수록 세포생존율과 세포증식율이 감소하였다. 유세포 분석을 이용하여 세포사멸 정도를 확인한 결과, 세포사멸이 일어나는 세포의 비율은 레이저티닙의 농도 의존적으로 증가하였고, 세포자멸사 관련 단백질들인 Cleaved caspase -3, -7, -9 및 PARP-1발현도 증가하는 것을 확인하였다. 세포자멸사의 경로를 확인하기 위해 실험을 진행한 결과 레이저티닙의 처리 농도가 높아짐에 따라 caspase 활성도가 증가하였다. 반면, 미토콘드리아 막전위는 감소하였고 그에 따라 세포질에 Cytochrome C가 축적되는 것을 확인했다. 세포자멸사 관련 단백질들인 Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1의 발현은 감소하고, Bax와 Bak의 발현은 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 세포주기를 분석한 결과 레이저티닙에 의한 G0/G1기의 정지를 확인하였고, 세포 주기 관련 단백질들인 Cyclin B1, Cyclin D3, Cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6와 p21cip1, p27kip의 발현 정도의 변화도 확인할 수 있었다. 결론: 레이저티닙이 다발골수종 세포주인 RPMI-8226 세포에서 caspase의 활성과 미토콘드리아의 막 전위 감소를 통해 세포사멸을 유도하며, 세포주기 정지를 일으켜 세포증식을 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 레이저티닙이 다발골수종의 새로운 치료 약물로 사용될 가능성을 제시하였다. |Background: Multiple myeloma is a disease caused by abnormal differentiation and proliferation of plasma cells, the last stage of the maturation process of B lymphocytes, and is characterized by excessive secretion of M protein, which is an abnormal monoclonal antibody, instead of a normal antibody. Common clinical symptoms include hypercalcemia, renal failure, anemia, and bone lesions. This disease is currently being treated with chemotherapy and hematopoietic stem cell transplantation, but it is difficult to cure and the risk of recurrence is high. Lazertinib is a drug used for non-small cell lung cancer that has mutated to existing treatments and is evaluated as a drug with good efficacy, but its effect in multiple myeloma is still unknown. Therefore, in this study, an experiment was conducted to investigate the effect of lazertinib on multiple myeloma cells and to evaluate the efficacy of the drug. Method: Lazertinib was treated with RPMI-8226 cells, a multiple myeloma cell line, and cell viability was confirmed using CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, and cell proliferation was confirmed using BrdU assay. After confirming the occurrence of apoptosis by Annexin V staining, caspase activity and Dioc6(3) staining were performed to determine whether apoptosis occurred and then, analyzed by flow cytometry. Cell cycle changes were observed with propidium iodide (PI)/RNase staining, and the expression of apoptosis and cell cycle-related proteins was confirmed by Western blot. Results: The positive and negative marker molecules of RPMI-8226 cells were confirmed to prove that it was a multiple myeloma cell line. When lazertinib was treated in RPMI-8226 cells, the cell viability and cell proliferation rate decreased as the concentration increased. As a result of confirming the degree of apoptosis using flow cytometry, the ratio of cells in which apoptosis occurs increased in a concentration-dependent manner of lazertinib, and it was confirmed that the expression of apoptosis-related proteins, cleaved caspase -3, -7, -9 and PARP-1 was increased. As a result of the experiment to confirm the apoptosis pathway, the caspase activity increased as the concentration of lazertinib increased. On the other hand, it was confirmed that the mitochondrial membrane potential was decreased and Cytochrome C was accumulated in the cytoplasm accordingly. It was confirmed that the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2, Bcl-xl, and Mcl-1 decreased, and the expression of Bax and Bak increased. As a result of cell cycle analysis, it was confirmed that the G0/G1 phase was stopped by lazertinib, and changes in the expression level of the cell cycle-related proteins Cyclin B1, Cyclin D3, Cyclin E, CDK2, CDK4, CDK6, p21cip1 and p27kip were also confirmed. Conclusion: In conclusion, it was confirmed that lazertinib induces apoptosis through caspase cascade activity and reduction of mitochondrial membrane potential in RPMI-8226 cells, a multiple myeloma cell line, and inhibits cell proliferation by causing cell cycle arrest. Based on these results, I suggested the possibility that lazertinib may be used as a new treatment for multiple myeloma.