사이토크롬 P450 의존적인 대사반응이 모화합물의 전자분무 이온화 질량분석법에 미치는 영향

Abstract

신약개발 초기 단계에서 대사체 연구는 약동학적 특성을 개선하기 위해 구조적으로 대사에 취약한 부분을 찾는 데에 초점을 둔다. 후기 단계에서는 종간 차를 비교함으로써 인간에서의 예측률을 높일 수 있는 독성시험에 적합한 동물 종을 찾기 위해 수행되고 있다. 2008년 Metabolites in Safety Testing (MIST) 가이드라인이 발표되면서 이러한 대사체의 정성적 분석뿐 아니라 정량적 분석이 강조되고 있다. 그러나 대사체 합성의 어려움으로 인해 대사체 표준품을 구하기 어려워 이를 정량하는 데에 그 한계가 존재한다. 본 연구에서는 액체 크로마토그래피 텐덤 질량분석기 (Liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)를 이용하여 phase Ⅰ 반응을 통해 생성되는 비교적 구조적 변화가 적은 대사체의 semi-quantification 방법을 검증하고자 하였다. 이를 위해 모화합물 28종과 이들 물질의 phase Ⅰ 반응으로 생성되는 대사체 37종을 선정하였다. 총 65종 화합물을 LC-MS/MS의 multiple reaction monitoring (MRM) mode와 4개의 컬럼을 이용한 정량분석법을 개발하였다. 또한 Korea Food and Drug Administration (KFDA) 밸리데이션 가이드라인에 따라 개발된 분석법을 검증하였다. 모화합물과 대사체의 이온화 정도는 area ratio로 구하였다. 대사체의 경우 모화합물과 대사체 각각의 MS 파라미터를 이용하여 분석 후 각 조건에 따른 area ratio 비율을 response factor (RF) 값으로 산출하였다. 실험 결과 phase Ⅰ 반응을 통해 생성된 대사체 (37종) 중 7종의 물질 (1-hydroxy midazolam, lansoprazole sulfone N-oxide, ranitidine N-oxide, BR-A-535, resorufin, lansoprazole sulfide, dehydronifedipine) 을 제외한 30종 대사체 (약 81%)의 RF 값은 ± 30% 오차 범위 내에 들어왔다. 오차 범위를 벗어난 물질의 경우 모화합물과 그 대사체의 물리화학적, 구조적 특징 및 MS 파라미터를 비교하여 구조 변화에 따른 이온화 정도의 변화 원인을 파악하고자 하였다. 결론적으로 모화합물과 그 대사체의 pKa 값의 차이가 1 이상이거나, 조각 이온 (fragment ion) 구조 내의 chloride (Cl) 포함 유무 또는 N-/S-oxide 와 같은 구조적 특이성을 가지는 경우 모화합물과 대사체의 이온화 조건이 크게 달라짐을 확인하였다. 이러한 물리화학적 및 구조적 특징을 지니는 경우, 모화합물과 그 대사체의 최적화된 MS 파라미터 중 collision energy (CE) 값의 차이가 5 이상인 것으로 관찰되었다. 이상의 결과를 종합하면 대사체의 semi-quantification 한계를 극복하기 위해서는 특히 대사체의 물리화학적 및 구조적 특징에 따른 CE 값의 조정이 매우 중요함을 시사하고 있다. |Metabolism studies in early drug discovery focus on finding structurally vulnerable chemical spots of the drug to improve its pharmacokinetic properties. In the later stages, it is performed to find animal species suitable for toxicity tests that can increase the prediction in humans by comparing species differences. As the Metabolites in Safety Testing (MIST) guidelines were published, quantitative as well as qualitative analysis of these metabolites are being emphasized. However, due to the difficulty of metabolite synthesis, it is difficult to obtain a metabolite standard, so there is a limit to quantification. In this study, using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), the semi-quantification method of metabolites with relatively small structural changes generated through the phase I reaction was verified. For this purpose, it was selected 28 parent compounds and their 39 corresponding metabolites produced by phase Ⅰ reaction. Total 65 compounds were quantitatively analyzed by LC-MS/MS using multiple reaction monitoring (MRM) mode and four different chromatographic columns. In addition, these methods were verified according to the Korea Food & Drug Administration (KFDA) validation guideline. The degree of ionization of each the parent compound and metabolite was calculated as an area ratio value. Metabolites were analyzed using MS parameters of the parent compound and metabolite respectively. Response Factor (RF) values were calculated using area ratio according to each condition. As a result, RF values of 30 metabolites (about 81% of 37 metabolites) were within ±30% error range, except for seven substances (1-hydroxy midazolam, lansoprazole sulfone N-oxide, ranitidine N-oxide, BR-A-535, resorufin, lansoprazole sulfide and dehydronifedipine). For substances outside the error range, physicochemical and structural characteristics and MS parameters of the parent compound and its metabolites were compared to determine the cause of the change in the degree of ionization according to the structural change. In conclusion, it was confirmed that ionization conditions of the parent compound and the metabolite were greatly changed when the difference in pKa values between the parent compound and the metabolite was greater than 1, chloride (Cl) was included in the fragment ion structure, or a structural specificity such as N-/S-oxide was present. It was observed that the difference in collision energy (CE) values among the optimized MS parameters of the parent compound and its metabolites was greater than 5 in the presence of these physicochemical and structural characteristics. Taken together, the above results suggest that in order to overcome the semi-quantification limit of metabolites, it is particularly important to identify the physicochemical and structural characteristics of metabolites and to adjust CE values according to structural features.