포르말린 고정 조직 (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue) 단백질체 분석을 위한 전처리 최적화 연구

Abstract

Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) tissue는 병리적 검사가 완료되어 병리과에서 보관 중이며 두께 조절을 통해 시료양을 조절하고 tumor 조직만 선별할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 많은 장점을 가진 FFPE tissue 시료지만 제작과정에서 protein-protein cross-linking을 형성하기 때문에 단백질 추출 및 단백질체 분석에 제한을 받게 된다. 이번 연구에서 동일한 FFPE tissue 시료를 이용하여 최적화된 단백질 추출 방법을 확인하고147개의 TNBC FFPE 시료에 대해 최적화된 방법으로 단백질을 추출하여 LC-MS 분석을 수행하여 치료 예후와 재발에 대한 바이오마커 발굴을 수행하였다. 2um의 FFPE tissue slice를 extraction buffer, AFA sonication 사용 유무, boiling 조건 등을 다르게 하여 3가지 조건으로 선정하여 단백질을 추출한 후 단백질 정량 하였다. S-Trap digestion 방법을 이용하여 펩타이드화 시키고 nano flow의 LCMS를 이용하여 분석된 데이터를 이용하여 동정된 단백질의 수, 펩타이드 수, PSMs의 수, C-term K/R ratio를 분석하여 최적의 추출법을 확인하였다. TNBC를 needle biopsy로 획득된 FFPE tissue를 전단계에서 확인된 최적화된 추출법으로 단백질을 추출하였고 SWATHLC-MS방법으로 데이터를 획득 후 차별적으로 발현되는 단백질을 확인하였다. 최적의 추출방법을 확인하기 위한 실험에서는 평균 700ug 이상의 단백질을 획득하였다. LC-MS로 얻은 데이터를 분석하여 각 조건별로 2,000개 정도의 단백질을 동정하였고 통계분석을 통해 동정률, 재현성, de-crosslink 정도를 확인하여 Test 1 (Extraction buffer EXB, boiling 100 ˚C에서 20분, 80 ˚C에서 4시간, AFA sonication 수행 안함)이 가장 우수하다는 것을 확인할 수 있었다. 단백질 추출의 최적화된 방법으로 core needle biopsy FFPE tissue 147개에서 단백질을 추출하고S-trap으로 얻은 펩타이드를 LC-MS 분석을 진행하여 각 비교군들에 대해 DEP를 발굴하였다. Non-pCR과 pCR을 비교하여 5개의 단백질을 발굴하였고 non-recurrence와 Recurrence를 비교하여 12개의 양적 차이를 갖는 단백질을 발굴하였다. 발굴된 단백질들을 biological function에 대해 분석하여 항암 치료 반응 및 재발에 대한 기능적인 연관성을 확인하였다.