C18 columns으로 단백질 정제와 농축 후 MALDI-TOF MS 시스템을 이용한 혈청 단백질 분석을 통한 유방암 진단

Abstract

목적 유방암은 여성에서 가장 많이 발생하는 암으로 발병률은 전세계적으로 증가하고 있다. 따라서, 조기 유방암 진단에 도움이 될 수 있는 바이오 마커를 발견하는 것은 매우 중요하다. 실제로 혈액을 통한 CA15-3, CEA 등의 종양표지자가 있으나 특이도와 민감도가 낮아 그 효용성이 떨어진다. 진단에 유용한 단백질/펩타이드의 바이오 마커를 확립하기 위한 단백질 연구가 폭넓게 진행되어 왔다. 임상 단백질체학은 질병 발생 중 변화를 연구하기 위해 다양한 펩타이드와 단백질의 분석에 초점을 맞추고 있다. 임상 단백질체학은 여러 질병의 임상 진단 뿐 만 아니라 다양한 암 치료 방법에 있어서 반응 정도를 평가하는 데까지 활용 가능 하다. 이것은 건강한 대조군과 암 환자의 검체 사이의 단백질 발현 또는 프로파일 차이를 비교하여 확인할 수 있으며 1,000 ~ 10,000Da의 저 분자량 혈청 펩타이드의 경우 중요한 바이오 마커 정보를 포함하고 있어, 많은 질병의 조기 진단을 위한 마커로 사용될 수 있다고 보고되었다. 단백질을 분석함에 있어, 인간의 혈청 샘플은 쉽게 얻을 수 있으며 다양한 기법과 기구에 의해 분리 및 분석할 수 있는 장점을 가지고 있어 진단 도구로 유용하다.

대상 및 방법 본 연구는 서울 아산병원에서 건강 검진 시 획득한 30명의 건강한 사람의 혈청 샘플과 30명의 유방암 환자의 혈청 샘플로 총 60개의 혈청 샘플을 얻었다. 혈청 단백질 또는 펩타이드 분자는 Peptide Cleanup C18 pipette tips (Cat # 5188-5239, Agilent Technologies)를 사용하여 프로토콜에 따라 정제 및 농축하여 MALDI-TOF MS를 통해 질량 분석하였다. 질량 스펙트럼은 m/z 및 절대 강도 값을 추출하여 TIC로 정규화 하였으며 heatmap, PCA plots 및 ROC곡선을 작성했다. m/z 값과 그에 상응하는 TIC 정규화 된 강도 값은 NosIDTM (NosQuest, 대한민국)이라는 소프트웨어를 통해 특이도, 민감도 및 정확도 값과 함께 기록된다.

결과 Heatmap을 통해 건강한 대조군 30명과 유방암 환자 30명의 통계적으로 유의한 m/z 피크의 패턴 차이를 보여줄 수 있었고 m/z 마커에 대한 건강한 대조군과 유방암 환자 사이의 정규화 된 강도 값은 통계적으로 유의한 차이를 보여주었다. 특히 4,150 m/z에서 분명한 차이를 볼 수 있었다. 본 연구의 진단 능력을 분석하기 위한 ROC 곡선을 그렸으며 0.932의 AUC 값으로 검증되었다. NosIDTM 프로그램을 사용하여 높은 특이도, 민감도 및 정확도 값을 얻어 확인하였고 건강한 사람과 유방암 환자 사이에서 TIC 정규화 강도 값에서 유의하게 차이를 보이는 6개의 질량 값을 확인하였다.

결론 본 연구에 사용된 샘플과 향후 연구에 사용된 샘플 간에 겹치는 m/z 값이 많이 있는 경우 이러한 m/z 값은 더 뛰어난 유방암 바이오 마커가 될 것이다. 또한 샘플 준비 단계의 변동을 최소화하기 위해 새롭고 개선된 방법이 요구되는데 실제로 변화에 취약할 수 있는 단계 중 하나인 Peptide Cleanup C18 pipet tip을 사용할 때의 혈청 단백질 정제 단계를 균일 화할 수 있는 더 많은 연구가 향후에 도움이 될 수 있으며, 이는 데이터를 보다 균일하고 정확하게 만들 수 있다. 또한 자동화된 샘플 준비 시스템을 사용하면 시스템이 인적 오류 및 변형을 제거하므로 보다 정확한 데이터 수집 과 바이오 마커 확인에 유리할 것이다.

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