담관 결찰 및 담낭 손상을 유도한 쥐 모델을 대상으로 나노-생체 기반의 표면 증강 라만 분광을 이용해 조기 담관 손상 측정 개발을 위한 실험 연구

Abstract

서론 1. 연구 배경 간 이식 후 간담도 기능 장애의 조기 진단과 적절한 치료 조치는 이식된 간의 비가역적 손상을 에방하는데 도움이 될 수 있다. 간 이식 초기에는 높은 면역 억제제 용량을 유지하게 되는데 이 때 감염의 위험이 높다. 따라서 면역 억제제를 필요 이상으로 많이 투여하면 심각한 감염 합병증을 유발할 수 있는 반면, 이식편 거부 반응이 있을 경우 반대로 면역억제제를 용량을 증가해야한다. 이식된 간의 거부 반응과 감염을 모니터링 및 구별하기 위해 여러 생체 화학적 간 기능 검사는 이식 후에 일상적으로 수행된다. 그러나 이러한 검사 중 어느 것도 거부 반응에 특이적이지 않으며 거부반응은 간외담도폐쇄, 상행 담관염, 바이러스 간염과 같은 빈번한 합병증과 결정적으로 구별할 수가 없다. 이를 위해 간 생검은 여전히 이 과정에서 중심적 역할을 한다. 그러나 간 생검은 샘플링 오류, 비용에 대한 부담 및 침습적인 시술로 혈액학적으로 불안정한 환자의 경우에 심각한 합병증을 유발할 수 있는 단점이 있다. 따라서 이식편의 모니터링을 위한 비침습적이고 실시간 합병증 진단이 가능한 기술의 개발의 필요성이 커지고 있다. 이와 관련하여 진동 분광 진단은 비침습적이며 세포 조직을 보존하며 추가 라벨링이 필요하지 않은 몇가지 이점이 있다. 적외선 및 라만 분광법과 같은 진동 분광법은 생물학적 시료의 화학적 및 분자적 변화를 조사하는데 현재 많은 연구 및 응용이 되고 있다. 이 접근 방식은 추가적인 라벨링이나 정제 없이 실시간으로 생체 분자 구성을 fingerprint 만들 수 있다. 라만 분광법은 샘플에 입사하는 광자의 비탄성 산란을 기반으로 한다. 입사 에너지가 각각의 분자에 따라 고유의 진동 모드에 의해 전환되기 때문에 스펙트럼의 개별 피크에는 구조 및 형태 정보가 포함된다. 따라서 라만은 질병을 진단할 수 있는 훌륭한 도구가 될 수 있다. 2. 연구 목적 이 연구의 목적은 간 이식 후 환자에게서 발생 가능한 담도 합병증 및 면역억제제 복용과 관련하여 감염 여부를 수술장 및 병실에서 조기에 진단 할 수 있는 나노 및 분광 융합 기술 시스템을 개발하는 것이다. 이를 위해 담도 염증 및 감염 상태를 대변하는 동물 실험을 진행하고 염증을 진단하기 위한 생체지표를 라만분광 기반 센싱칩을 이용해 측정하고 분석하는 실험을 진행하였고, 이 실험의 결과는 이 기술의 간 이식 환자 관리의 임상적 적용을 위한 가장 기초적 결과가 될 것이다. 이론적 배경 및 연구 방법 1. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)의 적용 및 ZnO nanorods 생성 라만 분광법은 조사된 샘플의 매우 좁은 스펙트럼 특징을 생성하는 진동 전이를 기반으로 화학 및 생물학적 시료의 식별과 분자 구조를 확인 할 수 있다. 하지만 라만 산란은 효율이 매우 떨어지는 단점이 있기 때문에 나노 크기의 금속 표면에 분자가 흡착되어 발생하는 surface-enhanced Raman scattering 효과로 라만 산란 신호를 크게 향상시켜 검출의 민감성을 극대화 시키는 표면 강화 라만 분광법 (Surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)이 개발되었다. SERS는 다양한 스펙트럼 정보와 낮은 수분 간섭, 그리고 매우 민감하고 분자에 따라 특이적인 fingerprint를 생성하기 때문에 복잡한 생화학적 조성을 가지고 주로 물을 포함하는 생체 검체를 위해 사용될 수 있다. 라만 효과를 최대화하기 위해서는 기판의 금속 구조 사이의 간격을 최적화하고 균일하게 배열된 금속 헤드 나노 구조를 가진 SERS 기판을 사용하는 것이 중요하다. 또한 개별 세포 구성 요소는 소량이고 낮은 라만 산란을 나타내기 때문에 높은 감도를 얻기 위한 효율적인 기판이 필요하다. 이를 위해 ZnO 나노로드를 성장시키고 코팅하여 선택적 생체 지표의 라만 분광 측정이 가능한 나노 구조체 기반 표면 증강 라만 센싱칩을 제작하였다. 현미경에 라만 분광 시스템을 설치하여 마이크로 단위의 포지션이 가능한 시스템을 구성하고, 제작된 표면 증강 라만 (SERS) 칩 탑재에 적합하도록 세팅하였다. 2. 쥐의 담관 결찰과 담낭 손상을 통한 담관 협착 모델 실험군/열 손상 모델 실험군 생성 간이식 환자의 담도염증 및 감염을 대변하기 위해 담관 협착 모델 동물 실험군과 간이식 후 있을 수 있는 열 손상을 모방한 동물 실험군을 제작하였다. 대조군으로서의 염증이 없는 동물의 담즙 검체 및 담관 협착 실험군과 열 손상 실험군의 라만 신호를 근간으로 분석된 결과와 생체지표 검출 결과를 비교하여 표면증강라만을 통한 진단의 유효성을 검토해 보았다. 3. 비표지 라만 신호의 분석을 실시하기 위한 기존 라이브러리를 확보하고, 획득 된 신호로부터 진단 기준을 마련하기 위한 PCA(Principal Component Analysis) 등의 통계분석을 실시하였다. 연구결과 대조군, 담관 협착 모델, 열 손상 모델 각각 쥐 10마리씩 실험하였다. 간 조직병리학 과 혈액 총 빌리루빈, 아스파르트산 아미노전이 효소 (aspartate aminotransferase, AST), 알라닌 아미노전이효소 (alanine aminotransferase, ALT)을 통해 간 기능을 평가한 결과, BDL 쥐에서 간기능이 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 간 조직에서 lipocalin-2, vimentin 수치를 측정하여 검증되었다. 반면 담낭의 H/E 염색을 통해 열소작에 의한 손상의 경우에만 담낭의 상피가 소실되는 것을 확인하였다. 그리고 시리우스 레드 염색을 통해서도 소실된 상피에서 담낭 내부로 콜라겐 조직이 노출되는 것을 확인하였다. 정상, BDL, 담낭 소작 모델의 검체에 대해 라만 스펙트럼을 얻었고, 담낭 소작 검체 에서만 의미 있는 피크가 나타났다. 이러한 피크의 대부분은 페닐 알라닌을 포함한 콜라겐 관련 공급원에서 발생하며, 이는 주로 생체 검체에서 발견된다. 이러한 라만 신호 할당 결과는 시리우스 레드 염색에서 볼 수 있듯이 상피 소실로 인한 고밀도 콜라겐 영역의 노출 결과와 일치한다. 주성분 분석을 통해 담낭의 열 손상 감지하는 기준을 확보하였다. 결론 쥐 BDL 모델을 이용하여 담관 협착으로 인한 간 손상을 유도, 소작을 통해 담낭 손상으로부터 담낭 (담관)에 대한 선택적 손상을 위한 샘플을 제조하여 그에 따른 라만 스펙트럼을 얻었고, 담낭 열 손상 모델에서만 의미있는 신호가 나오는 것을 확인하였다. 이 연구에서 성공적으로 얻어진 라만 신호 데이터의 분석 결과를 기반으로 기존의 배양 및 표지를 통해 진단하는 시간을 비약적으로 줄일 수 있고 임상 시료의 응용을 통한 진단의 민감도 및 특이도 향상에 대한 SERS 칩 기술의 가능성을 확인할 수가 있었다. 이식 초기의 전기 소작으로 인한 담관 손상을 SERS 를 이용하여 현장에서 실시간 모니터링하여 조기 진단을 할 수 있다면 간이식 후 환자 관리에 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다. 더 나아가 뚜렷한 결과를 얻기 위해 추후 다양한 매개변수 (SERS 기질, 이온 함량, 레이저 파장 등)를 조절하여 간 손상에 대해서 라만 스펙트럼 연구가 시행될 예정이다.