역형성 갑상선암과 전이성 분화 갑상선암에서 면역세포 프로파일링

Abstract

배경: 면역세포 프로파일링은 종양 내 미세환경을 반영하여 암의 진행을 예측하거나 치료의 표적을 선정하는데 중요하지만, 갑상선암에서 이에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 갑상선암 중 치료가 어렵고, 치명률이 높은 역형성 갑상선암과 전이성 분화갑상선암(전이성 분화암)에서 림프구 대 단핵구 비율(LMR)과 형광 다중 면역조직화학 염색법(F-MIHC) 및 다중 분광 영상 시스템(MSI)을 이용하여 면역세포 프로파일링을 실시하였다. 연구방법: 1994년에서 2020년까지 서울아산병원에서 수술 혹은 조직검사를 시행한 18세 이상의 역형성 갑상선암과 전이성 분화암 환자를 대상으로 하였다. LMR 분석은 기저 전혈구계산이 가능한 역형성 갑상선암 환자 및 소라페닙 치료를 받는 방사성 요오드 치료에 반응하지 않는 진행성 분화암 환자들을 대상으로 하였으며, receiver operating characteristic 곡선 분석을 통해 LMR 4를 기준으로 낮은 LMR군과 높은 LMR군을 분류하였다. 조직의 면역세포 프로파일링은 조직 슬라이드의 검토를 통해 추가적인 조직 블록 제작하고, 분석이 가능한 환자들을 대상으로 F-MIHC와 MSI를 이용하여 진행되었다. F-MIHC가 한번에 최대 6가지의 항원을 검출할 수 있어, 1차는 프로그램된 세포사멸 리간드(PD-L1)를 포함하는 T 림프구를 중점으로 분석하였고, 2차는 T 림프구 및 대식세포 및 이와 관련한 세포들을 중점으로 분석하였다. PD-L1에 대한 지표로 tumor proportion score(TPS)와 combined positive score(CPS)를 이용하였고, PD-L1 양성과 강양성의 기준은 각각 1이상과 50이상, 1이상과 20이상으로 정의하였다. 결과: 말초 혈액에서 역형성 갑상선암 환자 총 35명의 LMR을 분석한 결과, 낮은 LMR군에서 전체생존율의 중앙값이 3개월로 높은 LMR 군의 9.5개월에 비해 유의하게 낮았으며(p=0.004), 전체사망률에 대한 단변량 분석에서 hazard ratio(HR) 3.04(95 % confidence interval (CI) 1.37-6.77, p=0.007), 다변량 분석에서 HR 2.55(95% CI 1.08-6.00, p=0.032) 로 모두 유의하였다. 소라페닙 치료를 받는 방사성 요오드 치료에 반응하지 않는 진행성 분화암 환자 40명을 대상으로 한 분석에서도 낮은 LMR이 전체생존율 및 질병 무진행 생존에 유의한 감소 (p=0.015, p=0.019)를 보였으며, 전체사망률 및 질병의 진행에 대한 다변량 분석에서도 HR 2.64 (95% CI 1.04-6.72, p=0.041), 2.69 (95% CI 1.02-7.04, p=0.045) 로 모두 유의한 예후 인자로 확인되었다. 총 28명의 환자(역형성 갑상선암 16명, 전이성 분화암 12명)를 대상으로 한 PD-L1을 포함하는 1차 면역세포 프로파일링에서 PD-L1을 발현하는 종양세포를 비롯하여, 단위면적당(mm2) 총 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 세포 수가 모두 역형성 갑상선암에서 전이성 분화암에 비해 유의하게 높았다(모든 p<0.001). 각각의 림프구에서 PD-1과 PD-L1의 발현을 세분화하여 비교하였을 때에도 역형성 갑상선암에서 그 수가 유의하게 높았다(모든 p<0.001). TPS, CPS에서 양성인 경우는 역형성 갑상선암에서 81%, 94%로 모두 음성으로 확인된 전이성 분화암과 큰 차이를 보였다. 총 19명의 환자(역형성 갑상선암 12명, 전이성 분화암 7명)를 대상으로 한 2차 면역세포 프로파일링에서도 총 T 림프구(p=0.006), 자연살해세포((p=0.038), 대식세포(p<0.001), 골수유래 억제세포(p=0.003), 수지상세포(p=0.002) 모두 역형성 갑상선암에서 그 수가 유의하게 증가된 것이 확인되었다. 2차 분석에서 남녀 성별 및 말초 LMR에 따른 면역세포 프로파일을 분석하였는데, 여성에서 수지상세포의 수가 유의하게 높았으며(p=0.044), 낮은 LMR 군에서 대식세포의 수가 유의하게 증가되어 있음이 확인되었다(p=0.012). 결론: 말초혈액에서의 LMR 값은 역형성 갑상선암과 전이성 분화암에서 예후인자로 고려될 수 있다. 암조직에서 F-MIHC와 MSI를 이용한 면역 프로파일링을 통해 PD-L1의 발현 및 림프구 및 대식세포를 포함하는 면역세포들의 침윤이 역형성암에서 유의하게 높음을 확인하였고, 이를 통해 역형성암에서 암 면역을 표적으로 한 치료가 좀 더 효과적일 수 있음을 예측할 수 있다. 추가적인 면역 프로파일링을 통해 진행성 갑상선암의 새로운 치료 표적을 찾는 것이 필요하겠다. |Background: Analysis of the tumor microenvironment is a fundamental step in uncovering the details of tumor-host interactions that can lead to the development of novel therapies. Advanced thyroid cancers, including differentiated thyroid carcinoma (DTC) with distant metastasis, poorly differentiated thyroid carcinoma, and anaplastic thyroid carcinoma (ATC), are associated with poor clinical outcomes and limited treatment options. This study aimed to determine the immune profiles of advanced thyroid cancers using the lymphocyte-to-monocyte ratio (LMR) and fluorescent multiplex immunohistochemistry (F-MIHC) and multispectral imaging (MSI).

Method: We included patients aged over 18 years old who had pathologically confirmed diagnoses of DTC with distant metastasis or ATC between 1994 and 2020, at the Asan Medical Center, Seoul, Korea. We retrospectively analyzed patients with ATC or progressive radioactive iodine-refractory (RAIR) DTC who were treated by sorafenib with available baseline complete blood cell count (CBC) data. By ROC analysis, we sub-classified the patients into two groups: the low LMR group with LMR < 4 and the high LMR group with LMR ≥ 4. We assessed the response rate, progression-free survival (PFS), and overall survival (OS) according to the LMR.

To analysis of immune profiling, we included patients who could make additional tissue blocks through review of tissue slides by endocrinology pathologist. The samples were assessed using F-MIHC and MSI with antibodies against the cell surface molecules, cluster of differentiation (CD) 4, CD8, programmed cell death (PD-1), PD ligand 1 (PD-L1), forkhead box protein (Foxp)3, and cytokeratin (CK) for first analysis and CD3, CD11c, CD56, CD68, CD33 for second analysis. The expression of PD-L1 was evaluated using tumor proportion (TPS) and combined positive (CPS) scores.

Results: Among 35 patients with ATC, the OS curves were significantly different based on the LMR values, and the median OS of the low and high LMR groups was 3.0 and 9.5 months, respectively (p=0.004). In multivariate analysis, low LMR was also an independent risk factor for all-cause mortality in patients with ATC (HR, 2.55; 95% confidence interval (CI): 1.08-6.00, p=0.032) after adjusting for sex, tumor size and distant metastasis status. In 40 patients with progressive RAIR DTC, low LMR was associated with poor response rate and shorter disease control duration with sorafenib. The PFS curves differed significantly based on the LMR values and the median PFS of the low and high LMR groups (p=0.019). The OS curves also differed significantly based on the LMR. The median OS of the low LMR group was 24.3 months and that of the high LMR group was not reached until the end of observation period (p=0.015). In multivariate analysis, low LMR was an independent risk factor for all-cause mortality in patients with progressive RAIR DTC (hazard ratio [HR], 2.64; 95% confidence interval [CI]: 1.04–6.72, p=0.041).

In first analysis of immune profiling including PD-L1, total 28 patients (16 ATC, 12 DTC) were included. Significantly more PD-L1-positive tumor cells (CK+PD-L1+) per mm2 were found in ATC than in DTC samples (183.5 vs. 0.03, p<0.001). Lymphocyte infiltration was significantly increased in ATC compared with DTC with significantly more PD-L1 or PD-1-positive lymphocytes in ATC than in DTC samples. Notably, TPS and CPS indicated that PD-L1 expression was negative in all DTC samples but positive in 81% and 94% of ATC samples, respectively. In second analysis of immune profiling including macrophage, total 19 patients (12 ATC, 7 DTC) were included. Significantly more T lymphocytes (p=0.006), natural killer cells (p=0.038), macrophage (p<0.001), myeloid-derived suppressor cells (p=0.003) and dendritic cells (p=0.002) were found in ATC than in DTC samples. There was no significant difference of immune cell according to sex, except dendritic cell. Dendritic cell was significantly increased in female compared with male (107 vs. 13, p=0.044). More macrophages were found significantly in low LMR than in high LMR (706 vs. 149, p=0.012), whereas lymphocyte was no significantly different according to LMR.

Conclusion: Low LMR is associated with poor survival in patients with ATC and progressive RAIR DTC. LMR could be a simple and stable prognostic biomarker reflecting host immunity in patients with progressive thyroid carcinoma. Immune profiling revealed significant differences between advanced DTC and ATC, particularly in terms of PD-L1 expression and lymphocyte infiltration. Therefore, immune profiling using F-MIHC and MSI can provide invaluable information regarding tumor microenvironments, which could help select candidates for immunotherapy and create new targeted treatments for thyroid cancer.