A53T 돌연변이 파킨슨병 백서모델에서 그래핀 양자점 투여에 따른 치료효과

Abstract

노령화사회가 되면서 그에 따라 파킨슨병의 유병율이 높아지고 있으나, 치료법은 아직까지 레보도파, 뇌심부 자극술과 같이 위험성과 부작용이 있는 치료에 국한되어 있다. 병태생리적 접근을 통한, 보다 안전한 새로운 치료에 대한 필요성이 요구되며, 이와 관련하여 그래핀 양자점 투여를 통한 파킨슨병 치료를 시도하였다. 본 실험은 파킨슨병의 병태생리 중 하나인 a-synucleinopathy을 유발시키기 위해 21마리의 백서를 대상으로 a-synuclein을 과발현하는 돌연변이 유전자를 탑재한 바이러스(AAV-A53T)를 우측 중뇌 흑색질(substantia nigra)에 정위적으로 주입한 파킨슨병 동물 모델을 만들었다. AAV-A53T를 주입한 2주 후부터 일부의 백서들에게 그래핀 양자점을 다른 2가지 용량(1mg/day 또는 0.5mg/day)으로 10일간 매일 복강내 투여했으며, 이를 3개의 그룹(파킨슨병 대조군(PD control, n=8), 고용량 그래핀 양자점 투여군(HD graphene group, n=7), 저용량 그래핀 양자점 투여군(LD graphene group, n=6))으로 분류하였다. 기저상태와 파킨슨병 동물 모델로 제조된 후의 상태확인 및 투여된 그래핀 양자점의 치료효과를 확인하기 위해 행동검사(adjusting stepping test)를 AAV-A53T 주입 전 과 주입 후 2,3,4주차에 각각 시행하였다. 주입한 31일째 사후조직학적 평가를 통하여 치료효과를 검증하였으며, 3종류의 면역형광염색(tyrosine hydroxylase(TH, dopaminergic neuron marker), Iba-1(inflammatory microglia marker), a-Syn(a-synuclein))을 이용하였다. 행동검사는 세 그룹 모두 AAV-A53T주입한 후 2주차에 기저상태보다 병변 반대측의 step 수가 감소하였으며, 그래핀 양자점을 투여한 2그룹(HD graphene, LD graphene)은 모두 PD control그룹보다3주차, 4주차에 병변 반대측의 step수가 점차 개선됨이 통계적으로 유의하였다 (*p<0.05). 사후 면역형광염색에선 a-Syn으로 염색 시 PD control그룹의 병변 측은 건 측에 비해 발현이 증가되어 있으나, 그래핀 양자점을 투여한 2그룹은 PD control그룹보다 감소되어서 그래핀 양자점의 a-synuclein에 대한 효과를 확인할 수 있었다(*p<0.05). TH 염색에선 그래핀 양자점을 투여한 2그룹 모두에서 PD control그룹보다 병변 측에서 발현이 증가하였고(*p<0.05), Iba-1염색에선 세 그룹 모두의 병변 측에서 유의미한 변화를 확인하진 못했다. 본 연구는 도파민 분비 신경세포의neuroinflammation을 일으키는 주 원인인 a-synuclein 단백을 과발현하는 돌연변이 바이러스를 중뇌 흑색질에 정위적으로 주입하여 만든 파킨슨병 백서 모델을 통하여 복강내 투여한 그래핀 양자점이 파킨슨병에 치료 효과가 있음을 행동검사와 사후 면역형광염색 검사를 통해 확인하였다 |Accordingly with the aging society, the prevalence of Parkinson's disease is increasing for the previous decades. However, the treatment is still limited to levodopa and deep brain stimulation, which have risks and side effects. There is a need for a safer new treatment through a pathophysiological approach, and in this regard, the new treatment of Parkinson's disease was attempted through administration of graphene quantum dots(GQDs). This study inducted animal models of Parkinson's disease in 21 rats, which were injected the mutant virus (AAV-A53T) overexpressing a-synuclein, ipsilaterally into the right midbrain substantia nigra to induce a-synucleinopathy, as a main pathophysiology of Parkinson's disease. At two weeks after stereotactic AAV-A53T injection, GQDs was administered into the intraperitoneal space of rats by different doses (1mg/day or 0.5mg/day or none) for 10 days. They were divided into three groups (Parkinson’s disease control(PD control, n=8), high-dose graphene quantum dots(HD graphene, n=7), and low-dose graphene quantum dots(LD graphene, n=6)). The behavioral test was performed at pre- and 2, 3, 4 weeks after AAV-A53T injection, respectively, to confirm the underlying condition and to evaluate the animal model of Parkinson's disease and the therapeutic effect of GQDs. The therapeutic effect was verified through post-mortem immunofluorescent staining at 31 days after AAV-A53T injection, and three types of anti-bodies were used for immunofluorescent staining; tyrosine hydroxylase(TH, dopaminergic neuronal marker), Iba-1(inflammatory microglia marker) & a-Syn(a-synuclein). In the behavioral test, all groups showed a reduced number of contralateral steps of the lesion at 2 weeks after AAV-A53T injection, compared with the underlying state. HD & LD graphene groups showed the statistically significant improvement of contralateral steps of the lesion at 3,4 weeks after AAV-A53T injection(=1,2 weeks after graphene injection), compared with that of PD control group (*p<0.05). In immunofluorescent staining, the lesions of the PD control group were more expressed by a-Syn than that of the opposite side. However, the lesions of HD & LD graphene groups showed a reduced a-syn expression than that of PD control group, to reveal therapeutic effect to a-synuclein (*p<0.05). In TH staining, the lesions of HD & LD graphene groups showed an increased expression than that of the PD control group (*p<0.05), and in Iba-1 staining, no significant change was confirmed on the lesions in all three groups. This study confirmed that GQDs was effective in treating Parkinson's disease through a rat model of Parkinson's disease, which was made by injection of the A53T mutant virus (AAV-A53T) overexpressing a-synuclein protein, the main cause of neuroinflammation of dopamine-secreted neurons, into the substantia nigra.