반코마이신에 감수성이 저하된 황색포도알균의 발병 기전 및 유전자 발현 정도를 이용한 점수 체계의 진단적 유용성 평가

Abstract

배경: 반코마이신 사용이 증가하면서 반코마이신에 감수성이 저하된 메티실린 내성 황색포도알균 – 반코마이신 중증도 내성 황색포도알균(VISA), 반코마이신 불균질 중등도 내성 황색포도알균(hVISA)–이 증가하고 있고, 이러한 균에 의한 감염증은 반코마이신 치료 실패와 관련이 있을 수 있으므로 임상적으로 중요하다. 특히 hVISA는 일반적인 항균제 감수성 검사 방법으로는 검출 민감도가 낮고, 확진 방법인 인구집단 분석-곡선하면적(population analysis profile-area under the curve, PAP-AUC)은 많은 인력과 시간이 소모되어 실제 임상에서 사용하기가 어렵다는 문제가 있다. 또한 아직까지 반코마이신 감수성 저하의 기전이 정확히 규명되지 않았으며, 이러한 반코마이신 감수성 저하에는 다단계의 과정 및 다중 경로가 작용하는 것으로 추정된다. 따라서 반코마이신 감수성 저하의 기전을 파악하기 위하여 세포벽 관련 유전자의 발현 정도 차이를 유전자 기반 연구를 통해 분석하였고, transcriptome 분석 연구를 수행하여 발현의 차이를 나타내는 유전자를 선별하였다. 이후 이러한 유전자 및 표현형의 조합으로 점수 체계를 개발하여 반코마이신에 감수성이 저하된 메티실린 내성 황색포도알균의 진단 유용성을 평가하였다.

방법: 반코마이신을 투여함에도 지속적으로 MRSA가 분리되는 감염 환자에서 분리된 초기 반코마이신 감수성 황색포도알균(VSSA) 균주와 이후 hVISA로 변화된 균주 즉 isogenic paired strain과 실험실에서 생성한 isogenic paired strain, 그리고 짝이 없는 VSSA, hVISA 임상균주를 대상으로 하였으며, VSSA를 대조군, hVISA를 시험군으로 정의하였다. 세포벽과 관련된 유전자에 대한 실시간 중합효소연쇄반응 검사(RT-PCR)를 시행하여 발현 정도의 차이가 있는 유전자를 선정하였다. 또한 microarray법을 이용한 transcriptome 분석에서 대조군인 VSSA에 비해 시험군인 hVISA에서 발현 정도가 1.5배 이상 차이 나는 유전자를 선별하여 RT-PCR 검사로 발현 차이를 비교하였다. 이후 allele replacement 연구를 시행하여 표적 유전자가 비활성화된 경우 반코마이신 내성이 감소(또는 증가) 하는지 분석하였다. 다음으로 유전자 발현양에 따른 점수 체계의 개발 및 이의 임상적 유용성에 대해 평가하기 위해, 다수의 짝이 없는 임상균주 VSSA와 hVISA를 대상으로 하여 선정된 유전자의 발현 차이를 RT-PCR 검사로 비교 분석하였다. 이후 통계적, 임상적으로 의미있는 유전자를 조합하여 점수를 부여 후 Receiver operating characteristic (ROC) 커브 분석을 통해 민감도와 특이도를 구하여 MLST sequence type별로 민감도와 특이도가 가장 좋은 점수 체계를 개발하였다.

결과: 총 24쌍의 isogenic paired strain에서 세포벽과 표면 단백질 관련 유전자의 발현 차이는 prsA, graS, graR, spa, mprF에서 있었고, 총 4쌍의 isogenic paired strain의 transcriptome 분석에서는 세포벽 합성과 관련되거나 질소 대사, 요소분해효소 생성과 관련된 유전자들 (capAB, ureAB, lrgAB, splF, splC, atl, thiE, opp-2C, opp-2B, arcC, arcD, metB, gltB, adhE, norA, ilvB)이 의미있는 발현 증감 양상을 보였다. 이들 유전자에 대한 RT-PCR을 하였을 때 ST5에서는 capAB, atl, ST72에서는 ureAB, lrgAB 유전자가 의미있는 발현의 차이가 있었다. Allele replacement실험 시 ΔureAB, Δatl, ΔSA1221은 wild type 균주에 비해 약 20% 이상 PAP-AUC를 감소시켰으며, ΔlrgAB는 PAP-AUC에서 의미있는 변화가 없었고 (7-9% 감소), capAB유전자가 비활성화된 돌연변이주는 구축하지 못하였다. 이후 hVISA및 VSSA 임상균주 (hVISA ST5 30균주, hVISA ST72 16균주, VSSA ST5 30균주, ST72 20균주)에서 상기 유전자들에 대한 발현 정도 차이를 RT-PCR로 분석하였을 때 ST5는 graS, capA, capB, ST72는 sigB, ureAB, capA에서 유의한 차이를 보였다. 이후 ROC 커브 분석을 통하여 유전자/표현형 조합을 고안하였으며, ST5에서는 graS, capB, vancomycin MIC값 조합(AUC 0.92)에서 유전자 발현양에 따른 점수가 5점 이상일 때 민감도 86.6%, 특이도 83.0%, 양성예측도 83.8%, 음성예측도 86.2%였으며, ST72에서는 sigB, capA, ureB 유전자 발현양 조합(AUC 0.85)에서 6점 이상시 민감도 81.0%, 특이도 90.0%, 양성예측도 86.6%, 음성예측도 90.0%임을 확인할 수 있었다.

결론: 본 연구를 통해 hVISA는 VSSA와 비교하였을 때 세포벽 관련 및 캡슐 형성 유전자, global regulator, 요소 생성 및 질소 대사와 관련 있는 여러 유전자의 발현의 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 hVISA의 발생은 여러 단계의 경로가 복잡하게 작용하는 것을 시사하며 이러한 유전자들이 반코마이신 감수성 저하에 어떻게 기여하는지 연구가 추후 필요하다. 또한 이러한 유전자의 발현 정도를 기반으로 한 점수 체계는 민감도와 특이도가 우수한 것으로 판단된다. 점수 체계의 실제 임상 현장에서의 진단적 유용성은 추후 평가되어야 할 것으로 생각된다.