신장 이식 환자에서 Next Generation Sequencing기반 B Cell Repertoire 분석

Abstract

배경: 면역체계는 다양한 감염원 및 외부 물질로부터 신체를 보호하는 기능을 담당한다. 면역체계를 구성하는 다양한 종류의 면역세포, 신호전달체계는 체계와 균형을 이루고 있다. 면역 체계는 선천면역계와 적응면역계로 구성되어 있다. 적응면역계는 수많은 종류의 병원체, 항원에 반응하는 능력을 특징으로 하는데 이는 서로 다른 종류의 수용체를 통해 항원을 인식할 수 있고, 수없이 많은 종류의 항체를 통해 작용을 나타낼 수 있기 때문이다. 다양한 종류의 항체를 생성할 수 있는 기전을 repertoire 라고 하며 이를 adaptive immune receptor repertoire (AIRR)이라고 일컫는다. T세포수용체와 면역글로불린 항체의 종류가 수많은 항원을 인식할 수 있는 것은 다양한 클론의 면역세포가 존재하기 때문인데 이들이 생성하는 항체의 다양성을 확보하는 기전으로 V(D)J recombination, somatic hypermutation, class switching과 같은 중요한 기전들이 존재한다. 유전체 내에 넓게 분포하고 있는 V, D, J 유전자가 B cell의 성숙과정에서 재배열됨으로 인해 천문학적으로 많은 수의 다른 항원에 반응할 수 있는 다양한 종류의 항체를 생성할 수 있는 능력을 지니게 된다. 이식 면역은 장기이식 분야에서 면역 체계의 이해와 발전을 통해 이식 성적의 큰 향상을 이루어 낸 바 있다. 특히 신장이식의 성적은 효과적인 면역억제제의 개발로 이식성적이 크게 향상되었으나 장기적인 측면에서 이식 장기의 생존으로 평가하는 이식 성적의 향상은 2000년대 이후 제한적이었다. 현재 장기생존의 가장 큰 저해요인은 항체매개 거부 반응이며 이를 예측하거나 빠르게 진단할 수 있는 진단적 지표의 개발이 절실한 상황이다. AIRR 분석의 신장이식 분야에 대한 적용은 기존 연구에 의해 시도된 바 있지만 그 수가 매우 제한적이며 주로 T세포수용체에 국한되어 있다. 따라서 본 연구는 신장이식 환자의 B cell repertoire 분석을 위해 AIRR에 대한 차세대 염기서열분석을 적용해 보았다. 특히 AIRR 분석에 사용되는 다양한 종류의 도구와 기법 그리고 분석과정의 표준화에 대한 평가를 시행하여 장점과 단점 그리고 제한점 등을 검토하여 보편적 사용에 적합한 pipeline의 구축 가능성을 평가하고자 하였다. 방법: 서울아산병원에서 1996년 12월과 2021년 3월 사이의 기간동안 신장이식을 시행한 환자를 대상으로 하였다. ABO 적합 신장이식으로 한정하여 ABO 항체의 영향을 배제하고자 하였으며 이식 전 후 조직적합성 평가를 위해 시행된 검사 결과가 모두 있는 경우 연구에 포함하였다. 이들 가운데 2018년 1월로부터 2021년 7월 사이에 신장생검을 포함한 이식면역 관련 검사 및 평가가 진행된 환자들의 검체를 사용하였으며 총 15명의 보관 검체가 사용되었다. Banff 2017 Revised 진단기준에 따라 항체매개 거부 반응 환자군(ABMR)과 거부반응이 없는 환자군(NR)으로 나누어 분석을 시행하였고 두 군 사이의 AIRR의 특징적인 차이를 살펴보고자 하였다. 또한 AIRR 분석의 재현성과 read depth에 따른 clonotype의 차이를 살펴보고자 NCBI SRA로부터 보다 많은 수의 정상 대조군의 염기서열을 확보해 비교 분석을 진행하였다. 차세대 염기서열 분석은 BIOMED-2 프로토콜을 기반으로 개발 및 상용화 된 LymphoTrack IGH FR1 assay kit - MiSeq을 사용하였으며 이로부터 생성된 염기서열 데이터를 활용하였다. AIRR 분석은 preprocessing 과정의 중요성과 이로부터 나타나는 차이점을 살펴보고자 MiXCR, VDJPipe 그리고 LymphoTrack 세가지 pipeline을 비교하였고 AIRR 분석에는 공통적으로 clonality, diversity, CDR3 analysis 그리고 gene usage 항목에 대한 분석을 시행하였다. 결과: ABMR 군과 NR 군 사이에는 AIRR 분석결과에서 차이가 있음을 확인하였다. AIRR 분석 항목 가운데 clone 수와 clonotype의 수의 경우 개별 검체마다 큰 차이가 존재하였으며 이를 구분하기 위한 clonotype 5,000과 같은 특정 cutoff를 적용할 경우 통계적으로 매우 유의한 차이를 나타냈다. Diversity, clonality 항목에서도 검체 간, 군 간 차이를 보였지만 제한적인 검체 수, 특히 거부반응이 없는 환자군 수의 적음으로 인해 통계적 유의성은 관찰되지 않았다. Diversity의 경우 항체매개 거부반응군에서 분석에 사용된 Chao1, Hill number, D50 등 모든 지표가 낮게 관찰되었고 일치하는 경향성을 살펴보았다. 세가지 종류의 preprocessing pipeline을 비교하였을 때 MiXCR, LymphoTrack의 결과는 유사하였으며 clonotyping의 결과를 제외한 나머지 AIRR 분석의 경우 세가지 모두 일치하는 분석 결과 및 경향을 나타냈다. SRA의 정상 대조군 염기서열 분석을 통해 살펴본 결과 read depth가 높을수록 검출되는 clone의 수와 clonotype의 숫자가 증가하였다. 또한 검사 및 분석의 재현성을 살펴본 결과 read depth의 차이에 따른 clone 수가 다르게 검출되더라도 최종적인 clonotype의 수는 일정하게 검출됨을 확인할 수 있었다. 결론: 신장 이식 이후 환자군의 검체를 사용한 AIRR 분석 결과 항체 매개 거부 반응의 발현 유무에 따른 AIRR의 차이를 확인하였다. 검사의 다양성을 고려한 표준화 및 재현성의 측면에서 상용화된 LymphoTrack IGH assay kit는 사용 목적에 부합하였다. 본 연구에서 AIRR 분석에 사용된 LymphoTrack을 사용한 pipeline은 AIRR 데이터의 preprocessing, repertoire 분석을 효과적으로 시행할 수 있어 이후 보다 많은 수의 검체를 활용한 연구와 다양한 영역에 적용할 수 있을 것으로 기대된다.